氧化應(yīng)激和EndMT參與心房纖維化致心房結(jié)構(gòu)重構(gòu)的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的:
　　心房纖顫(atrial fibrillation)在臨床上較為普遍，隨全社會(huì)老齡化進(jìn)程逐日加劇，其發(fā)病率節(jié)節(jié)攀升，嚴(yán)重阻礙了人類健康的發(fā)展。究其關(guān)鍵點(diǎn)對(duì)是房顫發(fā)生和維持的分子機(jī)制研究不夠透徹。
　　目前，房顫基礎(chǔ)研究所涉及的主要分子機(jī)制包括電重構(gòu)、結(jié)構(gòu)重構(gòu)、自主神經(jīng)功能異常以及離子通道改變等。近幾年，結(jié)構(gòu)重構(gòu)領(lǐng)域得到了更多的關(guān)注，尤其是氧化應(yīng)激和纖維化的相關(guān)機(jī)制。機(jī)體在正常狀態(tài)下能夠產(chǎn)生抗氧化酶如SOD、MDA等

2、來(lái)清除多余的ROS，使體內(nèi)自由基的含量處于一個(gè)穩(wěn)態(tài)。氧化應(yīng)激發(fā)生時(shí)，機(jī)體內(nèi)過(guò)度氧化導(dǎo)致細(xì)胞損傷，產(chǎn)生過(guò)量的ROS，致肌漿網(wǎng)膜受損，使胞漿鈣濃度升高，心房肌纖維溶解，導(dǎo)致結(jié)構(gòu)重構(gòu)，其細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)表現(xiàn)為心肌纖維化。無(wú)論是動(dòng)物模型、臨床標(biāo)本還是細(xì)胞水平，均證實(shí)導(dǎo)致房顫治療后復(fù)發(fā)的重要原因之一是心肌纖維化改變，而成纖維細(xì)胞是纖維化發(fā)生的主要效應(yīng)器細(xì)胞，而心肌成纖維細(xì)胞來(lái)源不明確，以及多種病理?xiàng)l件下不同來(lái)源成纖維細(xì)胞組成的變化尚不清楚，故明確其來(lái)

3、源，阻斷心房纖維化進(jìn)程是近年來(lái)房顫基礎(chǔ)研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)科學(xué)問(wèn)題。近來(lái)發(fā)現(xiàn)通過(guò)心內(nèi)膜和微血管內(nèi)皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EndMT)可能是心肌中成纖維細(xì)胞的重要來(lái)源，即內(nèi)皮細(xì)胞在刺激因素如壓力負(fù)荷、炎癥介質(zhì)等作用下難以維持細(xì)胞外基質(zhì)的穩(wěn)定結(jié)構(gòu)，向間質(zhì)轉(zhuǎn)變、增生為成纖維細(xì)胞的過(guò)程。且病理狀態(tài)下，成纖維細(xì)胞具有更強(qiáng)的促纖維化能力，加快了心房肌纖維化進(jìn)程，參與心臟重構(gòu)的過(guò)程。
　　本研究擬通過(guò)觀察氧化應(yīng)激標(biāo)志物在兩組患者右房組織及血清中的表達(dá)來(lái)探討氧

4、化應(yīng)激在房顫心房重構(gòu)中的作用和意義，并在患者的心房肌組織中檢測(cè)α-SMA、S100A4、CD31mRNA和蛋白的表達(dá)變化來(lái)驗(yàn)證EndMT參與心房纖維化以及其在心房重構(gòu)中的作用，研究結(jié)果期望為房顫的臨床干預(yù)提供新的干預(yù)靶標(biāo)。
　　方法:
　　第一部分:氧化應(yīng)激標(biāo)志物在房顫患者心房結(jié)構(gòu)重構(gòu)中的變化和意義
　　研究對(duì)象:回顧性分析新橋醫(yī)院心血管外科2014年2月至5月入院，經(jīng)常規(guī)心臟超聲檢查診斷為單純二尖瓣病變的風(fēng)濕性心臟病

5、患者44例，根據(jù)病史及術(shù)前心電圖記錄分為2組。持續(xù)房顫組（AF組）26例，定義為房顫發(fā)作48h以上不能自動(dòng)轉(zhuǎn)復(fù)，需藥物等其他手段干預(yù)，持續(xù)時(shí)間≥6月，平均年齡（53.30±8.81）歲;竇性心律組（SR組）18例，定義為從未發(fā)生過(guò)房顫，平均年齡(50.37±13.03)歲。排除標(biāo)準(zhǔn):①合并冠心病、糖尿病、肝腎功能不全、甲功亢進(jìn)或甲狀腺功能減低、惡性腫瘤、心肌病等;②術(shù)前6月內(nèi)服用過(guò)任何類型的ACEI和ARB類藥物;③三尖瓣返流中度及以上

6、（定義為三尖瓣返流面積≥3cm2）;④房顫持續(xù)時(shí)間小于6個(gè)月;⑤年齡小于18歲或大于80歲;
　　組織標(biāo)本采集:在體外循環(huán)轉(zhuǎn)流開(kāi)始前，切取部分右心耳組織，剪去多余的脂肪組織后置入-80℃冰箱待測(cè);另于每組標(biāo)本中隨機(jī)抽取5例置于4％多聚甲醛溶液中固定24-36 h，常規(guī)石蠟包埋，連續(xù)切片（6-8張，片厚5μ m），用于Masson染色及免疫組化染色、免疫熒光染色。觀察心房纖維化情況，以及NOX2蛋白在右房組織的表達(dá)。
　　血液

7、標(biāo)本采集:手術(shù)前一天抽取患者靜脈血3ml，于室溫放置2小時(shí)待上下分層后于4℃1000 x g離心15分鐘，小心吸取上清液，仔細(xì)標(biāo)記并分裝于2個(gè)EP管中，于-80°冰箱中保存，取出使用時(shí)需要再次離心。
　　Masson染色:檢測(cè)心房纖維化。
　　免疫組化和免疫熒光染色:檢測(cè)兩組患者心房組織內(nèi)NOX2蛋白的表達(dá)變化。
　　ELISA法:對(duì)右心耳組織及血清中氧化應(yīng)激水平進(jìn)行測(cè)定。
　　第二部分:EndMT參與心房纖維化

8、在風(fēng)濕性心臟病合并AF患者心房結(jié)構(gòu)重構(gòu)中的意義
　　研究對(duì)象:選取2014年7月份至10月份，在新橋醫(yī)院心外科入院的42例接受單純二尖瓣置換術(shù)的風(fēng)濕性心臟病患者，納入和排除標(biāo)準(zhǔn)同第一部分，根據(jù)病史和術(shù)前24小時(shí)心電圖記錄分為2組:慢性房顫組(AF組)22例，竇性心律組(SR組)20例，分組標(biāo)準(zhǔn)同第一部分。術(shù)前行心臟多功能彩超測(cè)定各心腔大小及評(píng)價(jià)心功能。
　　標(biāo)本采集:在開(kāi)胸手術(shù)體外循環(huán)轉(zhuǎn)流前，切取右心耳組織約200mg，剪去

9、多余的脂肪組織后，將同一標(biāo)本分成三部分;一部分用4％多聚甲醛溶液固定24-36h后常規(guī)石蠟包埋，連續(xù)切片5-6張（片厚約6um）;一部分迅速置入-80℃冰箱，以備提取組織總RNA和蛋白;一部分用OCT劑包埋，置入-80℃冰箱，或立即行冰凍切片，用于免疫熒光雙標(biāo)染色。
　　Masson及Sirius-Red:觀察兩組患者心房纖維化程度。
　　RT-qPCR:檢測(cè)兩組患者心房組織中α-SMA、CD31、S100A4 mRNA含量

10、變化。
　　Western blot:檢測(cè)兩組患者心房組織中α-SMA、S100A4蛋白的差異性表達(dá)。
　　免疫組化、免疫熒光雙標(biāo)染色:檢測(cè)兩組標(biāo)本中α-SMA、CD31、S100A4蛋白表達(dá)差異的情況。
　　結(jié)果:
　　1.第一部分氧化應(yīng)激和心房重構(gòu)的相關(guān)結(jié)果:
　　(1)基線特征比較:AF組:男性7/26例，女性19/26例，SR組:6/18例，女性12/18例，AF組患者左房?jī)?nèi)徑(LADd)明顯大于S

11、R組[(55.57±10.76) vs(43.94±6.21)，P＜0.05]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;AF組左室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)顯著低于SR組[(63.12±7.66) vs(67.83±4.62)，P＜0.05]，AF組左房血栓和腦梗的發(fā)生率明顯高于SR組[11％ vs6％;2％ vs0％, P＜0.05]。
　　(2)兩組患者的免疫組化結(jié)果:AF組NOX2陽(yáng)性細(xì)胞面積area明顯高于SR組[(32005.72±8885.11)

12、 vs(6438.32±2849.63)，P＜0.05]，AF組積分光密度值高于SR組[(4705559±1225040) vs(1213255±421952)，P＜0.05]，相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異
　　(3)兩組患者ELISA結(jié)果:AF組右心耳組織內(nèi)ROS[(18.53±3.47) vsf(13.65±3.69),P＜0.01],SOD[(13.32±1.25) vs(10.65±1.15),P＜0.05]、MDA[(15.41±1

13、.69)vs(11.46±1.83)，P＜0.01]AOPP[(29.69+2.09) vs(21.94+1.94)，P＜0.01]的表達(dá)明顯高于SR組。AF組血清中ROS含量[(34.6+2.61)vs(17.8+1.03)，P＜0.05]明顯高于SR組，AOPP含量[(13.64+2.56) vs(13.27+3.38),P＞0.05]與SR組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　2.第二部分EndMT參與房顫心房結(jié)構(gòu)重構(gòu)的相關(guān)結(jié)果

14、r>　　(1)心肌間質(zhì)纖維化的觀察:masson染色和苦味酸天狼星紅染色發(fā)現(xiàn):AF組與SR組相比，右房組織膠原纖維增生明顯，特別是Ⅰ型膠原纖維，CVF顯著增高(P＜0.05);
　　(2)免疫熒光雙標(biāo)染色:通過(guò)激光共聚焦技術(shù)檢測(cè)AF組患者可見(jiàn)心肌間質(zhì)微血管內(nèi)皮有S100A4、CD31兩種蛋白熒光強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，而SR組只有CD31表達(dá)，S100A4蛋白表達(dá)較弱或沒(méi)有表達(dá)。
　　(3)免疫組化染色:兩組患者右房心肌組織中均有S10

15、0A4、α-SMA、V蛋白表達(dá)，AF組呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，SR表達(dá)較弱。
　　(4)實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè):AF組患者右心房組織中S100A4、α-SMA mRNA表達(dá)均顯著高于SR組(P＜0.05)，而AF組心房組織中CD31 mRNA表達(dá)低于SR組(P＜0.05);
　　(5)免疫印跡實(shí)驗(yàn)檢測(cè):AF組患者右心房組織中S100A4、α-SMA蛋白表達(dá)顯著高于SR組(P＜0.05);
　　結(jié)論:
　　1.房顫時(shí)左房?jī)?nèi)徑

16、增大更明顯，射血分?jǐn)?shù)減低，左房血栓及腦栓塞發(fā)生率明顯增高，而且發(fā)生了以心房纖維化為主的結(jié)構(gòu)重構(gòu)。
　　2.氧化應(yīng)激分子標(biāo)志物表達(dá)升高，以心房組織顯著，表明氧化應(yīng)激和心房纖維化密切相關(guān)，提示可能存在NADPH氧化酶/NOX2↑一體內(nèi)氧化應(yīng)激/炎癥介質(zhì)增加一纖維化改變-結(jié)構(gòu)重構(gòu)一房顫易感性增強(qiáng)這一鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。
　　3.EndMT參與了心房結(jié)構(gòu)重構(gòu)，心房肌組織中內(nèi)皮細(xì)胞可轉(zhuǎn)為化成纖維細(xì)胞參與心房纖維化，表現(xiàn)為成纖維細(xì)胞特異性標(biāo)志物α