豬圓環(huán)病毒2型與細(xì)胞自噬的相互作用.pdf

1、豬圓環(huán)病毒2型(porcinecircovirustype2，PCV2)可以引起豬的免疫功能抑制和持續(xù)性感染，其引起的豬圓環(huán)病毒相關(guān)疾病(PCVAD)是危害當(dāng)今全球養(yǎng)豬生產(chǎn)的最重要的病毒性傳染病之一，目前關(guān)于PCV2的致病機(jī)制仍然不清楚，因此深入探究PCV2致病機(jī)理十分必要。細(xì)胞自噬(Autophagy)在病原體感染過程中發(fā)揮著重要作用，與病毒的清除和逃避有關(guān)。本論文擬揭示PCV2感染誘導(dǎo)宿主細(xì)胞自噬的現(xiàn)象，分析細(xì)胞自噬在PCV2復(fù)制中

2、的作用，旨在從一個(gè)新視角為深入研究PCV2的致病機(jī)理奠定基礎(chǔ)。
　　 用PCV2SD/2008株感染或經(jīng)紫外線滅活后刺激PK-15細(xì)胞，運(yùn)用透射電鏡和激光共聚焦免疫熒光技術(shù)，分別檢測(cè)細(xì)胞中的自噬囊泡和自噬體標(biāo)志物L(fēng)C3分子以及自噬降解底物p62蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，PCV2活毒及滅活后均能誘導(dǎo)PK-15細(xì)胞產(chǎn)生大量的雙層膜和單層膜的自噬體樣囊泡，顯著提高自噬體標(biāo)志分子LC3的表達(dá)量，降低自噬底物p62的表達(dá)量。進(jìn)而用PCV2

3、SD/2008株感染5w健康巴馬香豬，感染后3、7、28d，在豬的淋巴結(jié)中的巨噬細(xì)胞和肝細(xì)胞胞漿內(nèi)可見大量自噬囊泡，在肺泡巨噬細(xì)胞以及淋巴結(jié)、脾臟、腎臟等組織細(xì)胞內(nèi)可檢測(cè)到自噬體標(biāo)志物L(fēng)C3分子表達(dá)。上述體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，PCV2可以誘導(dǎo)宿主細(xì)胞自噬的發(fā)生。
　　 為了明確自噬對(duì)PCV2復(fù)制的影響，在PCV2感染PK-15細(xì)胞之前或之后分別應(yīng)用自噬誘導(dǎo)劑雷帕霉素(rapamycin,Rapa)和自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤(3

4、-MA)人工改變宿主細(xì)胞的自噬活性，然后應(yīng)用透射電鏡、激光共聚焦免疫熒光、Real-timePCR及IPMA等技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞自噬囊泡、自噬標(biāo)志分子或PCV2核酸含量，分析自噬對(duì)PCV2復(fù)制的影響。結(jié)果顯示，利用Rapa誘導(dǎo)細(xì)胞自噬可顯著提高PK-15細(xì)胞內(nèi)PCV2核酸含量(P＜0.01)以及病毒滴度(P＜0.01)。表明細(xì)胞自噬可促進(jìn)PCV2在PK-15細(xì)胞中的復(fù)制。
　　 為了進(jìn)一步驗(yàn)證細(xì)胞自噬對(duì)PCV2在感染動(dòng)物內(nèi)復(fù)制的影響，

5、本研究首先應(yīng)用Rapa和3-MA建立了自噬誘導(dǎo)和自噬抑制的小鼠模型，然后將100只8周齡雄性BALB/c小鼠隨機(jī)分為4組，分別為PCV2感染自噬誘導(dǎo)(PCV2+Rapa)組、PCV2感染自噬抑制(PCV2+3-MA)組、病毒(PCV2)感染組和空白對(duì)照(PBS)組，每組25只。于感染后3、7、14、21、28和56d，每組隨機(jī)剖殺4只小鼠，取肝臟或脾臟檢測(cè)自噬現(xiàn)象與PCV2載量。結(jié)果顯示，感染后7、14d在自噬誘導(dǎo)小鼠的脾臟和肝臟混合物

6、內(nèi)沒有檢測(cè)到PCV2核酸，而于感染后21、28d顯著高于自噬抑制組和PCV2單獨(dú)感染組的含量(P＜0.01);自噬誘導(dǎo)小鼠肝臟、脾臟等組織中的病毒蛋白信號(hào)數(shù)量的變化趨勢(shì)與自噬體標(biāo)志分子LC3和Beclin信號(hào)數(shù)量的趨勢(shì)基本一致。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，細(xì)胞自噬參與了PCV2的感染過程，并對(duì)病毒在宿主細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制及持續(xù)感染產(chǎn)生影響。
　　 綜上所述，本研究證明PCV2感染可誘導(dǎo)細(xì)胞自噬，而細(xì)胞自噬對(duì)PCV2的體外復(fù)制有促進(jìn)作用，自噬有利