調(diào)控內(nèi)皮祖細(xì)胞自噬對(duì)深靜脈血栓溶解再通作用的研究.pdf

1、深靜脈血栓形成(Deep venous thrombosis，DVT)是臨床常見血管外科疾病，可導(dǎo)致患肢深靜脈瓣膜功能不全、疼痛、反復(fù)腫脹、淺靜脈迂曲擴(kuò)張、色素沉著、潰瘍及肢體壞死等，嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致致死性的肺栓塞(pulmonary embolism，PE)。目前傳統(tǒng)的藥物抗凝和溶栓以及手術(shù)取栓治療可引起機(jī)體凝血功能下降、消化道出血、手術(shù)患者切口并發(fā)癥發(fā)生等并發(fā)癥，且遠(yuǎn)期通暢率不理想，因此，如何更加有效的治療深靜脈血栓是血管外科醫(yī)生當(dāng)前極

2、為關(guān)注的研究方向。
　　骨髓來源的內(nèi)皮祖細(xì)胞(Bone marrow-derived endothelial progenitor cells BMEPCs)可以分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞，并分泌各種促血管生成因子從而促進(jìn)缺血組織的血管新生。相關(guān)研究證實(shí)，EPCs可以歸巢到深靜脈血栓中，進(jìn)而促進(jìn)血栓機(jī)化再通。但是由于血栓內(nèi)缺血缺氧的環(huán)境抑制EPCs的增殖、遷移和成血管等功能，因此如何更好的提高EPCs在缺氧環(huán)境下的功能成為其應(yīng)用于治療深靜

3、脈血栓的重點(diǎn)。
　　自噬是機(jī)體保留下來的高度保守的保護(hù)機(jī)制，與細(xì)胞的生長(zhǎng)、繁殖，以及腫瘤的發(fā)生過程關(guān)系密切；它還是機(jī)體對(duì)外源性刺激如饑餓、缺氧、感染、藥物、生長(zhǎng)因子及氧化應(yīng)激等的適應(yīng)性反應(yīng)，減少其對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生的毒性作用。相關(guān)研究表明，自噬與細(xì)胞功能有緊密的聯(lián)系，如在缺血組織中，上調(diào)細(xì)胞自噬水平可抑制細(xì)胞的壞死和凋亡。上調(diào)自噬可通過激活磷酸化AKT通路，從而對(duì)牛動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞的遷移和成血管功能具有明顯的促進(jìn)作用，下調(diào)自噬則抑制其功能。長(zhǎng)

4、時(shí)間的自噬會(huì)誘發(fā)細(xì)胞壞死和凋亡。查閱相關(guān)文獻(xiàn)，我們發(fā)現(xiàn)調(diào)控自噬水平對(duì)于EPCs的功能影響，特別在深靜脈血栓再通中的作用未見相關(guān)報(bào)道。
　　本研究的主要目的是探討自噬對(duì)內(nèi)皮祖細(xì)胞功能影響及促進(jìn)靜脈血栓再通的作用，為深靜脈血栓的治療提供一種新的治療思路。分為四個(gè)部分，主要研究方法及結(jié)果如下。
　　第一部分大鼠骨髓源性內(nèi)皮祖細(xì)胞的分離、培養(yǎng)及鑒定
　　目的：分離、培養(yǎng)并鑒定大鼠骨髓源性內(nèi)皮祖細(xì)胞(endothelial pr

5、ogenitor cells，EPCs)。
　　方法：采用密度梯度離心方法分離SD（Sprague-Dawley）大鼠骨髓單個(gè)核細(xì)胞（BMMNCs），采用內(nèi)皮培養(yǎng)體系EGM-2培養(yǎng)基進(jìn)行定向誘導(dǎo)分化培養(yǎng)14-21天，觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)形態(tài)變化，采用免疫組化、免疫熒光、流式細(xì)胞儀技術(shù)檢測(cè)造血干細(xì)胞表面標(biāo)記CD133及內(nèi)皮細(xì)胞表面標(biāo)記VEGFR、vWF，采用Matrigel成管實(shí)驗(yàn)及DiI-ac-LDL攝取實(shí)驗(yàn)檢測(cè)其成血管及吞噬功能。

6、r>　　結(jié)果：新分離的大鼠BMMNCs呈圓形，培養(yǎng)24-48h后可見其貼壁，細(xì)胞培養(yǎng)至第10～12天逐漸融合，并長(zhǎng)滿培養(yǎng)瓶底，呈現(xiàn)典型“鋪路石或鵝卵石樣”外觀；DiI-ac-LDL攝取結(jié)果顯示培養(yǎng)細(xì)胞具有內(nèi)皮細(xì)胞吞噬DiI-ac-LDL的特性；Matrigel成管實(shí)驗(yàn)可見細(xì)胞可形成血管腔樣結(jié)構(gòu)；流式細(xì)胞儀分析及免疫熒光檢測(cè)結(jié)果顯示，細(xì)胞高表達(dá)VEGFR、vWF等內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記物，低表達(dá)或幾乎不表達(dá)CD133造血干細(xì)胞標(biāo)記物。
　　結(jié)

7、論：成功地建立了一套大鼠骨髓血管內(nèi)皮祖細(xì)胞分離、培養(yǎng)、誘導(dǎo)分化及鑒定的方法體系。通過內(nèi)皮培養(yǎng)體系EGM-2的誘導(dǎo)培養(yǎng)，可從SD大鼠BMMNCs中獲得EPCs，培養(yǎng)到第14-21天的EPCs呈現(xiàn)晚期EPCs表型特征。
　　第二部分體外缺氧環(huán)境下自噬對(duì)內(nèi)皮祖細(xì)胞功能的影響
　　目的：探討自噬對(duì)大鼠EPCs增殖、遷移及成血管能力的影響，并探討其分子機(jī)制。
　　方法：分為三組，3-MA組（3-MA（+），3-MA（-））；AT

8、G5 siRNA組：將ATG5小干擾RNA（ATG5-siRNA）或陰性對(duì)照（NS）轉(zhuǎn)染到EPCs中；ATG5質(zhì)粒組：將ATG5質(zhì)粒（ATG5-pcDNA3.1）或陰性對(duì)照（pcDNA）轉(zhuǎn)染到EPCs中。各組EPCs于轉(zhuǎn)染24 h后或藥物處理20 h后于缺氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h（1％O2,5%CO2和94%N2，37℃），采用Rt-PCR及Western blot檢測(cè)各組EPCs中ATG5及Beclin-1的表達(dá)；采用MTT法檢測(cè)自噬對(duì)E

9、PCs增殖的影響；采用穿膜實(shí)驗(yàn)檢測(cè)自噬對(duì)EPCs運(yùn)動(dòng)遷移能力的影響；采用matrigel管腔形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)自噬對(duì)EPCs成血管能力的影響；采用Western blot檢測(cè)磷酸化AKT和非磷酸化AKT的表達(dá)水平。
　　結(jié)果：Rt-PCR及Western blot證實(shí)自噬抑制劑3-MA或ATG5-siRNA下調(diào)了EPCs中ATG5及Beclin-1的表達(dá)，而ATG5-pcDNA3.1則明顯上調(diào)了EPCs中ATG5及Beclin-1的表達(dá)

10、。MTT法、穿膜實(shí)驗(yàn)及matrigel實(shí)驗(yàn)說明上調(diào)自噬水平可促進(jìn)缺氧環(huán)境下EPCs的增殖、遷移及成血管功能，而下調(diào)EPCs自噬水平則抑制其增殖、遷移及成血管功能。上調(diào)自噬促進(jìn)EPCs功能的分子機(jī)制為激活磷酸化AKT。
　　結(jié)論：上調(diào)自噬水平可促進(jìn)缺氧環(huán)境下EPCs的增殖、遷移及成血管功能。
　　第三部分 ATG5慢病毒表達(dá)載體的構(gòu)建及其在內(nèi)皮祖細(xì)胞中的穩(wěn)定表達(dá)
　　目的：構(gòu)建ATG5慢病毒表達(dá)載體pUbi-MCS-EG

11、FP-ATG5，然后感染EPCs，建立穩(wěn)定表達(dá)ATG5的EPCs細(xì)胞，利用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（qPCR）驗(yàn)證感染后ATG5在EPCs的顯著提高，為研究體內(nèi)條件下自噬對(duì)EPCs在深靜脈血栓再通中的作用奠定基礎(chǔ)。
　　方法：將聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增得到的ATG5前體序列pre-ATG5和慢病毒載體pUbi-MCS-EGFP經(jīng)酶切后連接產(chǎn)生pUbi-MCS-EGFP-ATG5，再與輔助包裝載體一起在293T細(xì)胞中包裝病毒，收集

12、病毒顆粒后感染EPCs。用qPCR方法檢測(cè)感染后的EPCs中ATG5的表達(dá)。
　　結(jié)果：慢病毒表達(dá)載體pUbi-MCS-EGFP-ATG5構(gòu)建成功，病毒顆粒感染EPCs后能有效提高EPCs中ATG5的表達(dá)。
　　結(jié)論：成功構(gòu)建了pUbi-MCS-EGFP-ATG5慢病毒表達(dá)載體及穩(wěn)定表達(dá)ATG5的EPCs細(xì)胞系。
　　第四部分自噬對(duì)內(nèi)皮祖細(xì)胞在深靜脈血栓再通中的作用
　　目的：探討自噬對(duì)大鼠EPCs在深靜脈血栓機(jī)

13、化再通中的作用。
　　方法：使用慢病毒載體pUbi-MSC-EGFP/pUbi-MCS-EGFP-ATG5轉(zhuǎn)染EPCs，通過下腔靜脈結(jié)扎法構(gòu)建大鼠深靜脈血栓模型，再將轉(zhuǎn)染后的EPCs移植到大鼠血栓模型中，分別在術(shù)后7天、14天處死模型，取出血栓標(biāo)本。通過標(biāo)本稱重觀察血栓溶解情況；通過冰凍切片熒光示蹤觀察EPCs歸巢情況；通過HE染色觀察自噬對(duì)EPCs在深靜脈血栓機(jī)化中的作用；通過CD34免疫組化觀察自噬對(duì)EPCs在深靜脈血栓再通中

14、的作用。
　　結(jié)果：各組GFP陽性細(xì)胞數(shù)目比較：EPCs/ATG5組＞EPCs/vector組＞對(duì)照組，說明移植的EPCs可定向歸巢至深靜脈血栓中，上調(diào)EPCs中ATG5水平可顯著促進(jìn)其歸巢能力；各組血栓重量比較：對(duì)照組＞EPCs/vector組＞EPCs/ATG5組，可見EPCs移植后可促進(jìn)靜脈血栓溶解，上調(diào)EPCs中ATG5水平可顯著促進(jìn)其溶栓能力；HE染色和CD34免疫組化提示EPCs移植后可促進(jìn)血栓的機(jī)化再通，上調(diào)EPCs