調控內皮祖細胞自噬對深靜脈血栓溶解再通作用的研究.pdf

1、深靜脈血栓形成(Deep venous thrombosis，DVT)是臨床常見血管外科疾病，可導致患肢深靜脈瓣膜功能不全、疼痛、反復腫脹、淺靜脈迂曲擴張、色素沉著、潰瘍及肢體壞死等，嚴重時可導致致死性的肺栓塞(pulmonary embolism，PE)。目前傳統(tǒng)的藥物抗凝和溶栓以及手術取栓治療可引起機體凝血功能下降、消化道出血、手術患者切口并發(fā)癥發(fā)生等并發(fā)癥，且遠期通暢率不理想，因此，如何更加有效的治療深靜脈血栓是血管外科醫(yī)生當前極

2、為關注的研究方向。
　　骨髓來源的內皮祖細胞(Bone marrow-derived endothelial progenitor cells BMEPCs)可以分化為血管內皮細胞，并分泌各種促血管生成因子從而促進缺血組織的血管新生。相關研究證實，EPCs可以歸巢到深靜脈血栓中，進而促進血栓機化再通。但是由于血栓內缺血缺氧的環(huán)境抑制EPCs的增殖、遷移和成血管等功能，因此如何更好的提高EPCs在缺氧環(huán)境下的功能成為其應用于治療深靜

3、脈血栓的重點。
　　自噬是機體保留下來的高度保守的保護機制，與細胞的生長、繁殖，以及腫瘤的發(fā)生過程關系密切；它還是機體對外源性刺激如饑餓、缺氧、感染、藥物、生長因子及氧化應激等的適應性反應，減少其對細胞產生的毒性作用。相關研究表明，自噬與細胞功能有緊密的聯系，如在缺血組織中，上調細胞自噬水平可抑制細胞的壞死和凋亡。上調自噬可通過激活磷酸化AKT通路，從而對牛動脈內皮細胞的遷移和成血管功能具有明顯的促進作用，下調自噬則抑制其功能。長

4、時間的自噬會誘發(fā)細胞壞死和凋亡。查閱相關文獻，我們發(fā)現調控自噬水平對于EPCs的功能影響，特別在深靜脈血栓再通中的作用未見相關報道。
　　本研究的主要目的是探討自噬對內皮祖細胞功能影響及促進靜脈血栓再通的作用，為深靜脈血栓的治療提供一種新的治療思路。分為四個部分，主要研究方法及結果如下。
　　第一部分大鼠骨髓源性內皮祖細胞的分離、培養(yǎng)及鑒定
　　目的：分離、培養(yǎng)并鑒定大鼠骨髓源性內皮祖細胞(endothelial pr

5、ogenitor cells，EPCs)。
　　方法：采用密度梯度離心方法分離SD（Sprague-Dawley）大鼠骨髓單個核細胞（BMMNCs），采用內皮培養(yǎng)體系EGM-2培養(yǎng)基進行定向誘導分化培養(yǎng)14-21天，觀察細胞的生長形態(tài)變化，采用免疫組化、免疫熒光、流式細胞儀技術檢測造血干細胞表面標記CD133及內皮細胞表面標記VEGFR、vWF，采用Matrigel成管實驗及DiI-ac-LDL攝取實驗檢測其成血管及吞噬功能。

6、r>　　結果：新分離的大鼠BMMNCs呈圓形，培養(yǎng)24-48h后可見其貼壁，細胞培養(yǎng)至第10～12天逐漸融合，并長滿培養(yǎng)瓶底，呈現典型“鋪路石或鵝卵石樣”外觀；DiI-ac-LDL攝取結果顯示培養(yǎng)細胞具有內皮細胞吞噬DiI-ac-LDL的特性；Matrigel成管實驗可見細胞可形成血管腔樣結構；流式細胞儀分析及免疫熒光檢測結果顯示，細胞高表達VEGFR、vWF等內皮細胞標記物，低表達或幾乎不表達CD133造血干細胞標記物。
　　結

7、論：成功地建立了一套大鼠骨髓血管內皮祖細胞分離、培養(yǎng)、誘導分化及鑒定的方法體系。通過內皮培養(yǎng)體系EGM-2的誘導培養(yǎng)，可從SD大鼠BMMNCs中獲得EPCs，培養(yǎng)到第14-21天的EPCs呈現晚期EPCs表型特征。
　　第二部分體外缺氧環(huán)境下自噬對內皮祖細胞功能的影響
　　目的：探討自噬對大鼠EPCs增殖、遷移及成血管能力的影響，并探討其分子機制。
　　方法：分為三組，3-MA組（3-MA（+），3-MA（-））；AT

8、G5 siRNA組：將ATG5小干擾RNA（ATG5-siRNA）或陰性對照（NS）轉染到EPCs中；ATG5質粒組：將ATG5質粒（ATG5-pcDNA3.1）或陰性對照（pcDNA）轉染到EPCs中。各組EPCs于轉染24 h后或藥物處理20 h后于缺氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h（1％O2,5%CO2和94%N2，37℃），采用Rt-PCR及Western blot檢測各組EPCs中ATG5及Beclin-1的表達；采用MTT法檢測自噬對E

9、PCs增殖的影響；采用穿膜實驗檢測自噬對EPCs運動遷移能力的影響；采用matrigel管腔形成實驗檢測自噬對EPCs成血管能力的影響；采用Western blot檢測磷酸化AKT和非磷酸化AKT的表達水平。
　　結果：Rt-PCR及Western blot證實自噬抑制劑3-MA或ATG5-siRNA下調了EPCs中ATG5及Beclin-1的表達，而ATG5-pcDNA3.1則明顯上調了EPCs中ATG5及Beclin-1的表達

10、。MTT法、穿膜實驗及matrigel實驗說明上調自噬水平可促進缺氧環(huán)境下EPCs的增殖、遷移及成血管功能，而下調EPCs自噬水平則抑制其增殖、遷移及成血管功能。上調自噬促進EPCs功能的分子機制為激活磷酸化AKT。
　　結論：上調自噬水平可促進缺氧環(huán)境下EPCs的增殖、遷移及成血管功能。
　　第三部分 ATG5慢病毒表達載體的構建及其在內皮祖細胞中的穩(wěn)定表達
　　目的：構建ATG5慢病毒表達載體pUbi-MCS-EG

11、FP-ATG5，然后感染EPCs，建立穩(wěn)定表達ATG5的EPCs細胞，利用實時熒光定量聚合酶鏈反應（qPCR）驗證感染后ATG5在EPCs的顯著提高，為研究體內條件下自噬對EPCs在深靜脈血栓再通中的作用奠定基礎。
　　方法：將聚合酶鏈反應(PCR)擴增得到的ATG5前體序列pre-ATG5和慢病毒載體pUbi-MCS-EGFP經酶切后連接產生pUbi-MCS-EGFP-ATG5，再與輔助包裝載體一起在293T細胞中包裝病毒，收集

12、病毒顆粒后感染EPCs。用qPCR方法檢測感染后的EPCs中ATG5的表達。
　　結果：慢病毒表達載體pUbi-MCS-EGFP-ATG5構建成功，病毒顆粒感染EPCs后能有效提高EPCs中ATG5的表達。
　　結論：成功構建了pUbi-MCS-EGFP-ATG5慢病毒表達載體及穩(wěn)定表達ATG5的EPCs細胞系。
　　第四部分自噬對內皮祖細胞在深靜脈血栓再通中的作用
　　目的：探討自噬對大鼠EPCs在深靜脈血栓機

13、化再通中的作用。
　　方法：使用慢病毒載體pUbi-MSC-EGFP/pUbi-MCS-EGFP-ATG5轉染EPCs，通過下腔靜脈結扎法構建大鼠深靜脈血栓模型，再將轉染后的EPCs移植到大鼠血栓模型中，分別在術后7天、14天處死模型，取出血栓標本。通過標本稱重觀察血栓溶解情況；通過冰凍切片熒光示蹤觀察EPCs歸巢情況；通過HE染色觀察自噬對EPCs在深靜脈血栓機化中的作用；通過CD34免疫組化觀察自噬對EPCs在深靜脈血栓再通中

14、的作用。
　　結果：各組GFP陽性細胞數目比較：EPCs/ATG5組＞EPCs/vector組＞對照組，說明移植的EPCs可定向歸巢至深靜脈血栓中，上調EPCs中ATG5水平可顯著促進其歸巢能力；各組血栓重量比較：對照組＞EPCs/vector組＞EPCs/ATG5組，可見EPCs移植后可促進靜脈血栓溶解，上調EPCs中ATG5水平可顯著促進其溶栓能力；HE染色和CD34免疫組化提示EPCs移植后可促進血栓的機化再通，上調EPCs