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文檔簡介
1、目的:體外誘導分化的內(nèi)皮祖細胞(endothelial progenitor cells,EPCs),應用大自噬抑制劑3-MA(3-甲基腺嘌呤)干預后移植到大鼠深靜脈血栓模型體內(nèi),探討干預后的EPCs在血栓機化再通中的作用,為深靜脈血栓的治療提供一種新的思路和實驗依據(jù)。
方法:1. Ficoll密度梯度離心法獲取SD大鼠的骨髓單個核細胞(bone marrow-derived mononuclear cells,BMMNCs)
2、,內(nèi)皮祖細胞培養(yǎng)基(EGM-2MV)體外誘導分化為 EPCs并進行鑒定。觀察細胞形態(tài)學、內(nèi)皮細胞系列標志 VEGFR-2、vwF免疫組化,祖細胞標志CD133、CD34免疫熒光技術(shù)動態(tài)鑒定。MTT比色法觀察其增值能力。
2.血栓模型建立:采用縮窄腎下段下腔靜脈結(jié)合三氯化鐵浸潤破壞血管內(nèi)膜方法建立大鼠深靜脈血栓模型,并飼養(yǎng)至10d。動物隨機分四組,經(jīng)大鼠股靜脈穿刺注射1ml移植液體。A組(n=10):空白對照組,注射生理鹽水;B
3、組(n=10)EPCs移植組,移植含有106個EPCs的細胞懸液;C組(n=10):注射1ml3-MA稀釋液(5mmol/l);D組(n=10):移植1ml經(jīng)3-MA稀釋液(5mmol/l)處理后的EPCs的細胞懸液。3.移植后分四個時間段(0天、7天、14天、28天)取出血栓段下腔靜脈及血栓,應用免疫組織化學法、HE染色及電鏡檢測各組血栓中新生血管及機化再通的情況。4.采用SPSSl7.0軟件進行分析。
結(jié)果:1.新分離的骨
4、髓單個核細胞(BMMNCs)呈圓形,大小不一,第3天左右細胞開始出現(xiàn)貼壁,形態(tài)呈梭形、卵圓形、紡錘形、三角形或不規(guī)則形,一周左右可見細胞集落、細胞呈線狀排列,第10天左右細胞呈典型鵝卵石樣外觀。細胞生長曲線呈―S‖形, EPCs在培養(yǎng)的7~13天時增殖較快,14天后進入平臺期,生長曲線呈典型―s’’形外觀。貼壁細胞的CD34、VEGF、vWF、CD133均表達陽性。
2.體外成功誘導培養(yǎng)了大鼠骨髓源性EPCs;vWF免疫組化顯
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