骨髓細胞動員對靜脈血栓溶解、再通的作用及機理.pdf

1、研究背景： 靜脈血栓主要包括深靜脈血栓形成和肺栓塞，歐美國家每年靜脈血栓的發(fā)病率為每10萬普通人群中有100-200人。我國目前缺乏準確的數(shù)據(jù)統(tǒng)計。靜脈血栓是血管外科常見疾病，隨著人們生活水平的提高，近年來發(fā)病率顯著上升。靜脈血栓常引起血栓后綜合癥(postthrombotic syndrome)，使治療費用高，療效差。目前國內(nèi)外靜脈血栓的治療主要是抗凝和溶栓非手術措施?？鼓委煵荒苋コ呀?jīng)形成的血栓，溶栓治療只對血栓的表面部分

2、有效，其溶栓作用相當有限，溶栓治療并不能減輕血栓后綜合癥的嚴重程度，溶栓和抗凝治療有導致嚴重出血的風險。 本研究擬探討骨髓細胞動員對靜脈血栓溶解和再通的作用及可能機理。 研究方法： 1.動物實驗 Sprague-Dawley雄性大鼠隨機分為正常組、假手術組、血栓組和骨髓動員組。正常組未行任何處理。假手術組大鼠的下腔靜脈未行縮窄及阻斷，余處理同血栓組。骨髓動員組為模型鼠術后當d開始連續(xù)7d在腹部皮下按25u

3、g/kg注射rhG-CSF或rhGM-CSF，其余組注射等體積生理鹽水。大鼠靜脈血栓模型的建立參照Modarai方法加以改進。顯露左腎靜脈以下下腔靜脈至左右髂總靜脈匯合處，離斷并結(jié)扎該段下腔靜脈屬支，神經(jīng)血管鉗阻斷下腔靜脈1min，松開30s，再阻斷1min，順下腔靜脈放置頭皮針頭，以4-0絲線于左腎靜脈下方結(jié)扎下腔靜脈和頭皮針頭，取出頭皮針頭，縫合腹壁。術后動物自由飲水，正常飼養(yǎng)。 術后7d取血栓組和骨髓動員組下腔靜脈標本，術

4、后14d取假手術組、血栓組和骨髓動員組下腔靜脈標本。切取左腎靜脈以下下腔靜脈至左右髂總靜脈匯合處，用于組織形態(tài)學和免疫組化觀察。 術前0.5h，術后1、3、5、7和10d采集外周血，以全自動血細胞計數(shù)分析儀檢測白細胞總數(shù)，血涂片顯微鏡下計數(shù)MNC比例。 將4％多聚甲醛溶液中固定過夜的組織石蠟包埋，制成5μm厚的石蠟切片，于縮窄線以下開始切片，連續(xù)觀察間隔50μm的血栓病理組織切片3張，于顯微鏡下選定、攝取血栓的圖像，圖像

5、分析系統(tǒng)測定每張切片中血栓機化部分的面積和血栓總面積，計算二者比值的百分數(shù)，算出3張切片的平均百分數(shù)，即為該標本的血栓機化率。用CD68單抗定位血栓中巨噬細胞，圖像分析系統(tǒng)算出血栓的巨噬細胞密度。電鏡觀察血栓的超微結(jié)構(gòu)。 外周血中MCP-1和MIP-1α水平用ELISA法檢測，操作分別按大鼠MCP-1 ELISA Kit(BioSource)和大鼠MIP-1αELISA Kit(Antigenix)說明書進行。外周血總RNA提取

6、按Catrimox-14<'TM>RNA Isolation Kit Ver.2.11(TaKaRa公司)的說明步驟進行。RT-PCR擴增參照TaKaRaRNA PCR Kit(AMY)Ver.3.0試劑盒操作說明書進行。PCR產(chǎn)物用2％瓊脂糖凝膠電泳，溴乙啶染色。OD值行半定量檢測。 2.細胞實驗小鼠腹腔巨噬細胞株RAW264.7培養(yǎng)于含10％的小牛血清、100u/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)液中

7、。培養(yǎng)液中加入終濃度為0、20、40、80、160、320ng/ml的rhG-CSF或rhGM-CSF。1×10<'5>個細胞接種于24孔培養(yǎng)板，6×10<'5>個細胞接種于100ml培養(yǎng)瓶。ELISA檢測培養(yǎng)液中MCP-1和MIP-1α的水平，操作分別按小鼠MCP-1 ELISA Kit(Pierce)和小鼠MIP-1α ELISA Kit(Biosource)說明書進行。 培養(yǎng)的RAW264.7細胞總RNA提取按Catrim

8、ox-14<'TM>RNA Isolation Kit Ver.2.11(TaKaRa公司)的說明步驟進行。RT-PCR擴增參照TaKaRa RNA PCR Kit(AMV)Ver.3.0試劑盒操作說明書進行。PCR產(chǎn)物用2％瓊脂糖凝膠電泳，溴乙啶染色。OD值行半定量檢測。 按試劑盒說明提取RAW264.7細胞總蛋白。為防止磷酸酶的激活，所有的步驟均在冰上進行并加磷酸酶抑制劑。按BCA蛋白質(zhì)定量試劑盒說明書進行蛋白定量。等量蛋白

9、加樣于12％的聚丙烯酰胺凝膠后60mA下電泳，電轉(zhuǎn)膜至PVDF膜上。TTBS封閉1h，1：1，000抗CCR2抗體孵育，洗膜，1：5，000 HRP結(jié)合的兔抗羊IgG抗體孵育。內(nèi)參照GAPDH的檢測同上述方法。結(jié)果以DAB顯色，OD值行半定量檢測。 3.統(tǒng)計分析 采用SPSS10.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)資料進行統(tǒng)計分析。所有數(shù)據(jù)根據(jù)具體資料采用F檢驗、Dunnett檢驗、tukey′S檢驗或t檢驗。以P值<0.05為差異有顯著

10、性。 結(jié)果： 1.外周血MNC計數(shù)術后第3、5和7d，與血栓組(1.7±0.2，1.5±0.3，1.3±0.4)比較，骨髓動員組外周血MNC計數(shù)(rhG-CSF:2.1±0.3，3.1±0.2，4.4±0.3；rhGM-CSF：1.8±0.3，2.4±0.6，3.0±0.7)升高有顯著性差異。與rhGM-CSF骨髓動員組比較，術后第5d(t=2.95，P<0.05)和7d(t=3.53，P<0.01)，rhG-CSF骨髓

11、動員組升高有顯著性差異。 2.血栓機化率和電鏡結(jié)果術后7d和14d，與血栓組(15.6±2.3％，63.2±8.6％)比較，骨髓動員組血栓的機化率(30.2±3.5％，89.5±5.6％)有顯著性差異(P<0.01)。骨髓動員組中rhG-CsF和rhGM-CSF之間血栓機化率差異無顯著性。電鏡觀察顯示：與血栓組比較，骨髓動員組(rhG-CSF或rhGM-CSF)，巨噬細胞數(shù)量多，其周圍常見新生幼稚血管和成熟再通血管，巨噬細胞吞噬

12、功能活躍。 3.巨噬細胞密度術后第7d，與血栓組血栓內(nèi)巨噬細胞密度(1.47±0.8％)比較，rhG-CSF骨髓動員組(8.46±1.2％，P=0.0026)和rhGM-CSF骨髓動員組(7.84±1.1％，P=0.0041)均顯著升高。術后第14d，血栓組血栓內(nèi)巨噬細胞密度為5.52±0.7％，rhG-CSF骨髓動員組為13.52±1.3％(P=0.0087)，rhGM-CSF骨髓動員組為12.13±1.4％(P=0.0092

13、)。術后第7d和14d，rhG-CSF和rhGM-CSF骨髓動員組之間血栓內(nèi)巨噬細胞密度無顯著性差異。 4.MCP-1和MIP-1α水平大鼠外周血MCP-1和MIP-1α水平分別在術后7d和14d不同時點之間以及在相同時點不同組間均沒有顯著性差異。rhG-CSF或rhGM-CSF處理后，RAW264.7細胞分泌的MCP-1和MIP-1α水平?jīng)]有顯著性變化。 5.CCR2 mRNA表達與正常組比較，假手術組、血栓組和骨髓動

14、員組術后7和14d CCR2mRNA水平顯著升高(P<0.05)。骨髓動員組術后7和14d CCR2 mRNA水平均較血栓組顯著升高(P<0.05)。骨髓動員組rhGM-CSF和rhGM-CSF之間CCR2 mRNA水平無顯著性差異。 80ng/ml rhGM-CSF或rhG-CSF對RAW264.7細胞CCR2 mRNA的表達促進作用最強。RAW264.7細胞在80ng/ml rhGM-CSF或rhG-CSF培養(yǎng)363148h

15、后其CCR2 mRNA的表達穩(wěn)定增強，在培養(yǎng)12h后，rhGM-CSF對RAW264.7細胞CCR2 mRNA表達的促進作用強于rhG-CSF。 6.CCR2蛋白表達80ng/ml rhGM-CSF對RAW264.7細胞CCR2蛋白的表達促進作用最強。RAW264.7細胞在80ng/ml rhGM-CSF中分別培養(yǎng)36、48和60h后其細胞CCR2蛋白的表達逐漸增加。rhG-CSF對RAW264.7細胞CCR2蛋白的表達未見影響