衣原體噬菌體Chp3衣殼蛋白VP1的表達(dá)及蛋白間作用的研究.pdf

1、沙眼衣原體（Chlamydia trachomatis，Ct）是目前國(guó)內(nèi)外最常見(jiàn)的性病病原體之一，噬菌體（bacteriophage；phage）是一群能特異地感染宿主細(xì)菌并將其裂解的病毒，它不僅在分子生物學(xué)研究中起重要作用，作為抗菌劑治療細(xì)菌感染正日益受到重視。衣原體噬菌體是微病毒，分為2個(gè)亞組，研究顯示組成衣原體噬菌體殼的衣殼蛋白主要成分是Vp1、Vp2和Vp3，其中Vp1是最主要的結(jié)構(gòu)蛋白，這三種蛋白在噬菌體對(duì)衣原體的黏附和殖入中

2、可能有重要作用。本課題組已得到phiCPG1的衣殼蛋白，若能獲得另一亞組的衣殼蛋白既能推動(dòng)對(duì)噬菌體宿主噬性、衣原體與衣原體噬菌體相互作用的研究，也能推動(dòng)衣原體噬菌體分子工具設(shè)計(jì)的研究。
　　 目的：對(duì)衣原體噬菌體Chp3衣殼蛋白VP1蛋白進(jìn)行表達(dá)、純化及觀察其與衣原體蛋白的體外相互作用；初步探索多表位衣殼蛋白的設(shè)計(jì)和作用。
　　 方法：據(jù)Chp3vp1核酸序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析后以重疊延伸或/和基因合成獲得重組的密碼子優(yōu)

3、化核酸序列，將帶有重組基因的大腸桿菌BL21進(jìn)行卡那霉素抗生素平板篩選后，挑取生長(zhǎng)的單菌落培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期并提取重組質(zhì)粒測(cè)序，比對(duì)vp1基因測(cè)序結(jié)果和Genebank提供的vp1基因序列（GeneID:1261929）。IPTG誘導(dǎo)上述大腸桿菌BL21表達(dá)融合蛋白。細(xì)菌裂解物離心的上清和沉淀分別行SDS-PAGE電泳，以抗組氨酸標(biāo)簽抗體（Histagantibody）為一抗，Western blot技術(shù)鑒定融合蛋白并分析融合蛋白的表達(dá)形

4、式。優(yōu)化IPTG濃度和誘導(dǎo)時(shí)間后大量表達(dá)蛋白，以SDS-PAGE膠提純Vp1蛋白，考馬斯亮藍(lán)法對(duì)蛋白進(jìn)行定量。以Far Western blot技術(shù)檢測(cè)重組蛋白與衣原體蛋白及重組衣原體Pomp/Momp蛋白。生物信息生物學(xué)方法設(shè)計(jì)多表位擬衣殼蛋白，鑒定純化后初步探討其作用。
　　 結(jié)果：?jiǎn)蚊盖兄亟M質(zhì)?？梢?jiàn)在約8000bp處有單一DNA條帶，質(zhì)粒測(cè)序后比對(duì)結(jié)果示同源性為99.46％，為同義突變，氨基酸序列同源性為100％，重組質(zhì)粒

5、構(gòu)建正確。經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，SDS-PAGE電泳和Western Blot顯示從細(xì)菌裂解物離心沉淀中能獲得約55kD的衣原體噬菌體Chp3衣殼蛋白Vp1，細(xì)菌裂解物上清電泳未發(fā)現(xiàn)目的蛋白。誘導(dǎo)條件優(yōu)化后，證實(shí)采取37℃、0.3mM IPTG及誘導(dǎo)2小時(shí)為最適誘導(dǎo)條件。蛋白定量為126.3ug/ml。透析復(fù)性后以Vp1多克隆抗體Western blot鑒定示55KD處出現(xiàn)顯色條帶。Far Westernblot結(jié)果示提純目的蛋白與衣原體

6、碎菌上清中分子量約40KD蛋白有顯色條帶，但與衣原體Momp及Pomp蛋白均無(wú)顯色條帶。分析各株衣原體噬菌體抗原表位后設(shè)計(jì)擬衣原體噬菌體衣殼蛋白，重新分析示擬蛋白抗原表位分布與原衣原體噬菌體株相似，誘導(dǎo)蛋白后，40KD附近有檢測(cè)條帶，以?xún)?yōu)化后的表達(dá)條件37℃、0.08mM IPTG4小時(shí)誘導(dǎo)表達(dá)后獲得鑒定后的純化蛋白條帶。誘導(dǎo)后菌體蛋白稀釋640倍后，Westernblot鑒定可見(jiàn)單一目標(biāo)條帶。
　　 結(jié)論:1、重組質(zhì)粒構(gòu)建正確