對蝦素CHP3和CHP5的原核與真核重組表達(dá)及性質(zhì)研究.pdf

1、抗菌肽是在動物、植物和微生物中廣泛存在的一類分子量低、水溶性強(qiáng)、熱穩(wěn)定性好的廣譜抗菌活性物質(zhì)。它是機(jī)體受到病原感染后，經(jīng)過對病原的識別、信號傳導(dǎo)進(jìn)而被激活的一系列免疫效應(yīng)物中很重要的一類。對抗菌肽的研究有助于加深人們對先天免疫系統(tǒng)作用機(jī)制的了解。同時由于抗菌肽的多方面特點(diǎn)，也使得抗菌肽在疾病的預(yù)防與治療、藥物的開發(fā)、食品的保鮮與儲藏以及農(nóng)業(yè)、畜牧業(yè)、水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)生產(chǎn)有著巨大的應(yīng)用前景。 對蝦素是一類結(jié)構(gòu)獨(dú)特的抗菌肽，并在多種對蝦

2、中都有發(fā)現(xiàn)。目前，將對蝦素分為5類，不同的對蝦素都表現(xiàn)出對革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌和真菌的抗菌活性。對蝦素的研究主要集中在對其表達(dá)模式、重組表達(dá)和結(jié)構(gòu)與活性研究等方面。本實(shí)驗(yàn)室首先從中國對蝦中克隆得到兩種中國對蝦素(Ch-penaeidin-3和5，Chp3、Chp5)。本論文將這兩種中國對蝦素作了重組表達(dá)的研究、性質(zhì)的研究并制備了多克隆抗血清： 1.CHP3、CHP5在大腸桿菌中的重組表達(dá)。成功構(gòu)建了mchp3-pGEX-

3、4T-1、mchp5-pGEX-4T-1重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化大腸桿菌(Escherichiacoli)BL21。GST-CHP3、GST-CHP5得到高表達(dá)量的誘導(dǎo)表達(dá)。用親和純化的方法對融合蛋白進(jìn)行了純化。凝血酶裂解融合蛋白去除GST，用液體抑制的方法對目的蛋白CHP3、CHP5進(jìn)行了抑菌活性檢測。CHP3表現(xiàn)出一定的抑菌活性而CHP5的抑菌活性不強(qiáng)。 2.用大腸桿菌原核表達(dá)純化得到的融合蛋白GST-CHP3、GST-CHP5免疫

4、家兔，制備了兔抗CHP3和CHP5多克隆抗血清，免疫雙擴(kuò)散檢測抗血清滴度最高達(dá)到8倍稀釋，Westernblot顯示兔抗CHP3多克隆抗血清對大腸桿菌表達(dá)的GST-CHP3以及酵母分泌表達(dá)的CHP3能較好的識別。兔抗CHP3和CHP5多克隆抗血清的制備為進(jìn)一步研究中國對蝦素的表達(dá)模式和殺菌機(jī)制打下基礎(chǔ)。 3.對CHP3進(jìn)行了畢赤酵母細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的研究。構(gòu)建了帶有四個表達(dá)框的4×mchp3-pAO815的重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化畢赤酵母(Y

5、eastPichiapastoris)KM71，篩選得到轉(zhuǎn)化菌株并進(jìn)行了誘導(dǎo)表達(dá)，但無法檢測CHP3的表達(dá)情況。用pGAPα-A載體和pPIC9K載體對CHP5進(jìn)行了畢赤酵母細(xì)胞外分泌表達(dá)的研究。構(gòu)建了CHP5-pGAPα-A和CHP5-pPIC9K重組質(zhì)粒。轉(zhuǎn)化畢赤酵母KM71，在培養(yǎng)上清中檢測有表達(dá)產(chǎn)物。用離子交換層析對表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行了純化。牛津杯法檢測到純化產(chǎn)物對大腸桿菌等有一定的抗菌活性，進(jìn)一步進(jìn)行了抗菌譜的測定。結(jié)果表明，純化產(chǎn)