華南地區(qū)口蹄疫流行毒株VP1基因核苷酸序列分析及FMDV衣殼蛋白前體P1在FCV中的表達(dá).pdf

1、口蹄疫(Footandmouthdisease)是由口蹄疫病毒(Footandmouthdiseasevirus)引發(fā)的感染豬、牛和羊等偶蹄動(dòng)物的一種急性、熱性、高度接觸性人獸共患疾病。其易感動(dòng)物種類多、傳播速度快、流行范圍廣、難以防治，嚴(yán)重降低家畜生產(chǎn)性能并影響國(guó)際間動(dòng)物及畜產(chǎn)品的貿(mào)易。目前，國(guó)內(nèi)主要采取疫苗免疫進(jìn)行防制。
　　 本研究將獲得的2010年廣東口蹄疫毒株O-ST-2010的衣殼蛋白VP1核苷酸序列同往年華南地區(qū)的

2、流行株及參考株的VP1核苷酸序列進(jìn)行比對(duì)分析，并建立遺傳進(jìn)化樹。結(jié)果顯示，O-ST-2010毒株同我國(guó)分離株O/HLJOC12/03相似性最高，為93.8％；與東南亞型各參考毒株的相似性在92.2％-83.3％之間，而與其他基因型的毒株的相似性均在85％以下。且同往年華南地區(qū)的流行株，在拓?fù)湫蜕戏诸惒⒉粚儆谕蛔V系。往年華南地區(qū)的流行株為新豬毒系或泛亞系毒株（屬于古典中國(guó)型或中東-南亞型），而O-ST-2010毒株為云南耿馬系（屬于東南

3、亞型）。當(dāng)前我國(guó)使用的疫苗株均為古典中國(guó)型或中東-南亞型，尚無(wú)針對(duì)東南亞型毒株的疫苗。流行毒株基因型的改變，意味著病毒抗原性的改變。導(dǎo)致華南地區(qū)當(dāng)前使用的疫苗保護(hù)力降低，使得華南地區(qū)口蹄疫的防控面臨嚴(yán)峻的形勢(shì)，盡快研制出針對(duì)東南亞型毒株的疫苗迫在眉睫。
　　 為了評(píng)估FCV作為基因工程載體的可行性，開(kāi)辟FMD重組活載體疫苗新的途徑，本研究將FMDV衣殼蛋白前體P1插入到貓杯狀病毒(FelineCalicivirus，F(xiàn)CV)感染

4、性克隆載體中，構(gòu)建成重組的FCV。FCV是單股正鏈RNA病毒，基因組大小約為7.8kb，屬于杯狀病毒科囊病毒屬的成員，是貓科動(dòng)物中廣泛流行的高度接觸傳染性的重要病原體。為了驗(yàn)證FCV3C樣蛋白酶識(shí)別基序是否為8個(gè)氨基酸，將FMDVP1內(nèi)部的蛋白酶切位點(diǎn)突變?yōu)镕CV3C樣蛋白酶的識(shí)別基序，即蛋白酶切位點(diǎn)處的N端和C端各4個(gè)氨基酸共8個(gè)氨基酸序列。將突變后的P1基因即P1M2分別插入到FCV感染性克隆載體的前導(dǎo)蛋白LC中及LC后的位點(diǎn)，構(gòu)建

5、成重組病毒載體rmFCV-LC-P1M2和rmFCV-EA-P1M2，并轉(zhuǎn)染F81細(xì)胞。通過(guò)間接免疫熒光、RT-PCR、SDS-PAGE及Western-blot驗(yàn)證FMDVP1基因在FCV中的表達(dá)，并比較重組FCV同親本FCV的復(fù)制生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)。結(jié)果顯示，兩個(gè)嵌合體病毒皆能引起細(xì)胞病變；間接免疫熒光檢測(cè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞有熒光產(chǎn)生；轉(zhuǎn)染細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)物RT-PCR鑒定有大小約2232bp的目的片段；SDS-PAGF電泳結(jié)果顯示有大小分別為83kD和6

6、3kD的目的條帶，與設(shè)計(jì)的FMDVP1蛋白及FCV衣殼蛋白大小正好相符，表明所設(shè)計(jì)的3C樣蛋白酶能夠?qū)1M2進(jìn)行酶切修飾，使FCV重組病毒表達(dá)獨(dú)立的結(jié)構(gòu)蛋白，識(shí)別基序起到預(yù)期的作用；Western-blot檢測(cè)結(jié)果顯示重組毒表達(dá)的83kD的目的蛋白具有反應(yīng)原性;重組病毒rmFCV-EA-P1M2同親本毒的生長(zhǎng)曲線基本一致，而rmFCV-LC-P1M2的生長(zhǎng)水平(TCID50)則相對(duì)較低。上述結(jié)果證實(shí)FMDVP1在FCV中成功獲得表達(dá)，