IL-1α不同功能亞型表達系統(tǒng)的構(gòu)建及其在急性淋巴細胞白血病細胞系中的生物學(xué)功能研究.pdf

1、第一部分，IL-1α不同功能亞型表達系統(tǒng)的構(gòu)建
　　目的：IL-1α為IL-1家族的主要成員，它在炎癥與腫瘤發(fā)生中都可能發(fā)揮重要的作用。然而，其免疫調(diào)節(jié)作用及機制還不十分明確。有研究發(fā)現(xiàn)IL-1α前體可以入核，但其具體的功能機制并不清楚；另有研究表明，膜型IL-1α可能促進了免疫細胞的遷移和激活，而肝細胞壞死后釋放的IL-1α則激發(fā)了過度的炎癥反應(yīng)并促進了腫瘤的發(fā)生。為了能夠研究不同功能亞型的IL-1α在炎癥與腫瘤發(fā)生中的作用，本

2、課題將構(gòu)建體內(nèi)實驗與體外實驗所需要的方法學(xué)平臺，為進一步研究入核型、膜型和釋放的IL-1α與炎癥及腫瘤發(fā)生反應(yīng)的關(guān)系提供研究基礎(chǔ)。
　　方法：利用PCR的方法克隆IL-1α不同亞型，經(jīng)過連接到T載體測序正確后，利用不同限制性內(nèi)切酶組合切割成不同接頭的片段，連接到pCDNA3.1真核表達載體，minicircle真核表達載體，pDsRed真核表達載體，pET30b原核表達載體。形成分別用于體內(nèi)活體成像的表達系統(tǒng)，用于原位定位的表達系

3、統(tǒng)，以及用于制備IL-1α入核型多克隆抗體的抗原原核表達系統(tǒng)。最終通過水流動力學(xué)在小鼠肝臟內(nèi)表達，分別利用活體成像技術(shù)，組織切片及激光掃描細胞儀來檢測體內(nèi)表達情況。
　　結(jié)果：分別克隆IL-1α基因的不同亞型片段，連接至不同的表達載體?；铙w成像表達系統(tǒng)可以借助水流動力學(xué)高壓注射的方法在小鼠肝臟內(nèi)表達IL-1α亞型，并且通過活體成像檢測螢火蟲素酶產(chǎn)生的信號來監(jiān)控和檢測IL-1α的表達。在原位定位表達系統(tǒng)中，將小鼠肝臟制作冰凍切片，利

4、用激光掃描細胞儀檢測其熒光信號。原核表達系統(tǒng)中，使用IPTG誘導(dǎo)能實現(xiàn)大量IL-1α入核型融合蛋白的優(yōu)勢表達。
　　結(jié)論：經(jīng)過一系列分子克隆操作，成功構(gòu)建了IL-1α不同功能亞型用于活體成像的真核表達系統(tǒng)和用于原位定位表達檢測的真核表達系統(tǒng)，以及用于IL-1α入核型多克隆抗體制備的原核表達系統(tǒng)。為后續(xù)體內(nèi)與體外表達和功能實驗，以及抗體檢測奠定了基礎(chǔ)。
　　第二部分，IL-1α不同功能亞型在急性淋巴細胞白血病細胞系中的生物學(xué)功

5、能
　　目的：研究在急性淋巴細胞白血病細胞系過表達IL-1α不同亞型對細胞增殖，細胞周期，細胞凋亡的影響。以及在外界脅迫下過表達野生型、膜型和入核型IL-1α對細胞功能的影響。
　　方法：在人急性淋巴細胞白血病Jurkat細胞系中過表達IL-1α不同功能亞型。利用MTT的方法檢測不同亞型對細胞增殖的影響。利用7AAD對細胞核進行染色檢測IL-1α不同亞型對細胞周期的影響，使用annexin V與7AAD雙染的方法檢測IL-1