SLC25A38基因在急性淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞中的表達(dá)及其功能的初步研究.pdf

1、目的:
　　急性淋巴細(xì)胞性白血病(ALL)是一類造血干細(xì)胞來源的惡性克隆性疾病，近年來，靶向殺傷治療已成為ALL治療的發(fā)展趨勢(shì)，分析ALL發(fā)生機(jī)制、尋找新的治療靶點(diǎn)成為研究熱點(diǎn)。溶質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族(solutecarrier，SLC)是細(xì)胞內(nèi)最大的一類轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族，主要功能是介導(dǎo)線粒體基質(zhì)與膜間隙或膜間隙與細(xì)胞質(zhì)之間的溶質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)，為線粒體提供正常運(yùn)轉(zhuǎn)所需的物質(zhì)保障。SLC25A38基因定位于染色體3p22，是一種氨基酸載體，初步研究結(jié)

2、果證實(shí)，SLC25A38蛋白與神經(jīng)細(xì)胞的凋亡和退行有密切聯(lián)系，在造血器官（胚鼠肝臟和骨髓）中大量表達(dá)，可能與造血細(xì)胞的增殖分化有關(guān)。為了探討SLC25A38基因?qū)Π籽〖?xì)胞增殖、分化的影響，分析其與ALL患者臨床特征的關(guān)系，我們?cè)O(shè)計(jì)了本實(shí)驗(yàn)。
　　方法:
　　1.收集55例初治急性淋巴細(xì)胞白血病患者（其中兒童23例、成人32例）做為實(shí)驗(yàn)組，20例非惡性血液病患者（其中兒童10例，成人10例）做為對(duì)照組。通過實(shí)時(shí)熒光定量RT-

3、PCR及Westernblot方法檢測(cè)SLC25A38基因在mRNA和蛋白表達(dá)水平的變化。分析SLC25A38蛋白表達(dá)與ALL患者初診時(shí)臨床特征、化療反應(yīng)和療效之間的關(guān)系。對(duì)部分成人SLC25A38蛋白表達(dá)陽性患者進(jìn)行隨訪，檢測(cè)不同疾病狀態(tài)下SLC25A38蛋白表達(dá)水平的變化。
　　2.用含10％胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基體外培養(yǎng)骨髓瘤細(xì)胞株(RPMI8226及U266細(xì)胞)和白血病細(xì)胞株（K562、MOLT-4及Jurk

4、at細(xì)胞）。通過Westernblot方法檢測(cè)SLC25A38蛋白在各細(xì)胞株的表達(dá)水平，同時(shí)檢測(cè)Notch1蛋白在各細(xì)胞株和成人ALL患者中的表達(dá)水平。
　　3.以高表達(dá)SLC25A38蛋白的Jurkat細(xì)胞為模型，構(gòu)建針對(duì)SLC25A38基因的shRNA，轉(zhuǎn)染Jurkat細(xì)胞并經(jīng)G418篩選出穩(wěn)定轉(zhuǎn)染株。實(shí)驗(yàn)分4組:SLC25A38-shRNA1組（Sh1組）、SLC25A38-shRNA2組（Sh2組）、scramble-sh

5、RNA組（NC組）和Jurkat空白對(duì)照組（Ctrl組）。Westernblot和實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測(cè)各組細(xì)胞SLC25A38蛋白和mRNA的表達(dá)情況。MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況;流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡情況;給予不同濃度阿霉素作用后，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組不同濃度阿霉素作用下細(xì)胞凋亡情況變化。
　　結(jié)果:
　　1.SLC25A38基因在ALL細(xì)胞中的表達(dá):mRNA水平分組中，將對(duì)照組mRNA相對(duì)表達(dá)量設(shè)定為1。兒童組

6、中＜1組ALL患兒SLC25A28mRNA的相對(duì)表達(dá)量為0.2659±0.2874，＞1組的相對(duì)表達(dá)量為3.1418±1.0607，兩組SLC25A38mRNA的相對(duì)表達(dá)量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.0001)。成人組中＜1組ALL患者SLC25A28mRNA的相對(duì)表達(dá)量為0.3200±0.3382，＞1組的相對(duì)表達(dá)量為1.6707±0.6094，兩組SLC25A38mRNA的相對(duì)表達(dá)量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.0003)。蛋白水平分組中

7、，兒童ALL組SLC25A38蛋白陽性率34.78％(8/23);成人組蛋白陽性率46.9％(15/32);20例對(duì)照組均未檢測(cè)到SLC25A38蛋白表達(dá)。
　　2.臨床特征、治療反應(yīng)和療效:mRNA水平分組中，兒童及成人小于對(duì)照組（＜1組）與大于對(duì)照組（＞1組）兩組患者在性別、年齡、免疫分型、初診時(shí)外周血白細(xì)胞數(shù)、血紅蛋白量、血小板、骨髓原始細(xì)胞數(shù)等臨床特征之間的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。蛋白水平分組中，兒童ALL組S

8、LC25A38蛋白表達(dá)陽性組與陰性組在性別、免疫分型、初診時(shí)外周血白細(xì)胞數(shù)、乳酸脫氫酶之間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而兩組在年齡、初診時(shí)外周血血紅蛋白數(shù)、血小板、骨髓原始細(xì)胞數(shù)、初診時(shí)肝脾大、出血、淋巴結(jié)腫大、初診時(shí)CNSL/TL、潑尼松反應(yīng)、完全緩解率與復(fù)發(fā)率之間的差別沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）;成人ALL組SLC25A38蛋白表達(dá)陽性組較陰性組初診時(shí)外周血白細(xì)胞數(shù)升高(P＜0.05)，而兩組在性別、免疫分型、初診時(shí)外周

9、血血紅蛋白數(shù)、血小板、骨髓原始細(xì)胞數(shù)之間的差別沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。
　　3.蛋白水平與腫瘤負(fù)荷:隨訪觀察2例SLC25A38蛋白陽性的成人ALL患者發(fā)現(xiàn)，給予聯(lián)合化療達(dá)血液學(xué)緩解后，其SLC25A38蛋白表達(dá)水平明顯下降甚至消失，而疾病復(fù)發(fā)時(shí)再次出現(xiàn)，且其表達(dá)水平與復(fù)發(fā)時(shí)骨髓原始細(xì)胞比例呈正相關(guān)性。
　　4.白血病細(xì)胞株中SLC25A38蛋白的表達(dá):5種骨髓瘤或白血病細(xì)胞株均表達(dá)SLC25A38蛋白，其中以Jur

10、kat細(xì)胞表達(dá)量最高。
　　5.對(duì)Notch蛋白表達(dá)的影響:對(duì)各骨髓瘤或白血病細(xì)胞株及成人ALL樣本同時(shí)檢測(cè)Notch1蛋白發(fā)現(xiàn)，SLC25A38蛋白與Notch1蛋白在各細(xì)胞株及成人ALL樣本中均存在共同表達(dá)。
　　6.SLC25A38基因沉默對(duì)白血病細(xì)胞增殖的影響:MTT結(jié)果表明，Sh1組和Sh2組細(xì)胞的OD490值明顯高于陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義沉默SLC25A38基因后Jurkat細(xì)胞的增殖加快。<

11、br>　　7.SLC25A38基因沉默對(duì)白血病細(xì)胞周期影響:流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期結(jié)果表明，Sh1組和Sh2組細(xì)胞G0/G1期比例減少，S期與G2/M期比例增加，表明基因沉默后Jurkat細(xì)胞生長(zhǎng)加快。
　　8.SLC25A38基因沉默對(duì)白血病細(xì)胞凋亡影響:SLC25A38基因沉默后，各組細(xì)胞凋亡率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）;給予不同濃度阿霉素作用后，Sh1組和Sh2組細(xì)胞只比對(duì)照組細(xì)胞凋亡率有所上升，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

12、(P＞0.05)。
　　結(jié)論:
　　1.SLC25A38基因異常表達(dá)在兒童和成人ALL中是一種普遍的現(xiàn)象，但mRNA表達(dá)與蛋白表達(dá)水平不一致。
　　2.SLC25A38蛋白高表達(dá)與ALL患者外周血白細(xì)胞數(shù)等臨床特征相關(guān)，且與ALL腫瘤負(fù)荷有關(guān)。
　　3.通過shRNA技術(shù)成功靶向沉默SLC25A38基因可以促進(jìn)Jurkat白血病細(xì)胞增殖，對(duì)細(xì)胞凋亡過程無顯著影響。
　　4.沉默SLC25A38基因不影響Ju