CTLA-4單鏈抗體與HBsAg共修飾的DC疫苗抗HBV免疫的研究.pdf

1、本研究共分三個(gè)部分。 研究目的： 克隆小鼠CTLA-4單鏈抗體，構(gòu)建能穩(wěn)定表達(dá)ScFv及HBsAg-ScFv的真核質(zhì)粒載體，對(duì)表達(dá)的目的蛋白進(jìn)行純化及親合力測(cè)定。 研究方法： 復(fù)蘇并亞克隆分泌CTLA-4單抗的雜交瘤細(xì)胞株4F10并獲得高滴度細(xì)胞株，反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增該抗體的VH和VL基因，T-A克隆并測(cè)序分析。根據(jù)VH4F10、VL4F10基因序列以及載體多克隆位點(diǎn)內(nèi)切酶的核酸序列設(shè)計(jì)引物，通過重

2、疊延伸拚接法擴(kuò)增到ScFv4F10基因，測(cè)序核實(shí)后分別克隆到pSectag2B空載體和pSectag2B-S中，成功構(gòu)建真核分泌型表達(dá)載體pSect2/ScFv4F10和pSect2／S-ScFV4F10。 研究結(jié)果： 1.成功克隆了CTLA-4的單鏈抗體ScFV4F10，VL基因全長(zhǎng)339bps，VH基因全長(zhǎng)345bps，分別編碼113和115個(gè)氨基酸殘基。 2.成功構(gòu)建了可穩(wěn)定表達(dá)SeFV4F10和S-ScF

3、V4F10的真核質(zhì)粒載體，蛋白印跡表明其表達(dá)的蛋白分別約28 KDa和52 KDa。 3.純化的ScFV4F10、S-ScFv4F10蛋白均能競(jìng)爭(zhēng)抑制CTLA-4親本單抗與重組CTLA-4抗原的結(jié)合。 研究結(jié)論： 1.成功克隆了小鼠CTA-4的單鏈抗體ScFv4F10; 2.成功構(gòu)建了能高效表達(dá)ScFV4F10和S-ScFv4F10的真核質(zhì)粒載體pSect2／ScFV4F110和pSect2／S-$cFv

4、4F10； 3.純化了真核質(zhì)粒載體pSect2／ScFv4r10、pSect2／S-ScFv轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞所分泌表達(dá)的目的蛋白，驗(yàn)證了其與CTIA-4抗原具有較高的結(jié)合活性。 第二部分 目的：構(gòu)建能高效轉(zhuǎn)導(dǎo)ScFv4F10和S-ScFv4F10基因的重組腺病毒，進(jìn)行病毒擴(kuò)增和滴度測(cè)定。 研究方法： 應(yīng)用AdEasyTM XL腺病毒載體系統(tǒng)分別構(gòu)建表達(dá)ScFV4F10和S-ScFv4v10的重組腺病

5、毒Ad-ScFv和Ad-S-ScFv。病毒顆粒在AD293細(xì)胞中進(jìn)一步擴(kuò)增，并用Reed-Muench法測(cè)定病毒滴度。流式細(xì)胞術(shù)分析對(duì)照Ad-GFP轉(zhuǎn)染DC的熒光表達(dá)效率，Western檢測(cè)ScFv和S-ScFv在DC中的表達(dá)。 研究結(jié)果： 1.PCR和測(cè)序分析顯示，穿梭載體和重組腺病毒質(zhì)粒均含有完整的ScFV4F10和S-ScFV4F10基因序列。Westem鑒定了ScFv、S-ScFv蛋白的正確表達(dá)。 2.通

6、過Reed-Muench法測(cè)定第二代重組腺病毒滴度，結(jié)果Ad-ScFvr、Ad-S-ScFv均達(dá)108/ml。 3.對(duì)照Ad-GFP以MOI為100轉(zhuǎn)染小鼠骨髓來源的DC細(xì)胞。 4.流式細(xì)胞術(shù)分析表明，各組rAd／DC均能一定程度地吞噬OVA卵白蛋白，且均能分泌一定量的IL-12，但各組間沒有顯著性差異。 5.無論是同種異體還是自體MLR，各組DC刺激T細(xì)胞增殖的功能沒有顯著性差異。經(jīng)DC刺激后，自體MLR中CD

7、3+CD8。Th和CD3+CD8+Tc細(xì)胞均以分泌IFN-γ為主，表現(xiàn)為Thl／Tel型。 研究結(jié)論： 1.成功構(gòu)建了復(fù)制缺陷型重組腺病毒載體，且能高效轉(zhuǎn)染DC細(xì)胞并有效表達(dá)目的蛋白。 2.證實(shí)Ad-ScFv、Ad-S-ScFv體外轉(zhuǎn)導(dǎo)小鼠骨髓DC后，不影響DC的表型成熟、抗原吞噬和IL-12分泌能力。 3.與其余各組DC相比，Ad-S-ScFv轉(zhuǎn)導(dǎo)的DC刺激同種異體和自體T細(xì)胞增殖活性的能力相當(dāng)，但其誘

8、導(dǎo)Thl／Tcl細(xì)胞因子應(yīng)答的作用更為明顯。 第三部分 目的：以Ad-S、Ad-ScFv轉(zhuǎn)導(dǎo)DC為對(duì)照，探討．Ad-S-ScFv轉(zhuǎn)導(dǎo)的DC誘導(dǎo)HBV轉(zhuǎn)基因小鼠抗HBV免疫的作用特點(diǎn)、相關(guān)分子機(jī)制及其對(duì)HBV持續(xù)感染的可能治療作用和應(yīng)用前景。 研究方法： 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)免疫后Tg鼠脾臟T細(xì)胞內(nèi)HBsAg特異性IFN-γ+CD8+T細(xì)胞的比例，ELISA法檢測(cè)脾細(xì)胞HBsAg特異性IL-2、IFN-γ和IL-

9、10的分泌水平。CFSE摻入法測(cè)定脾細(xì)胞HBsAg特異性的T細(xì)胞增殖與CTL殺傷活性，ELISA檢測(cè)血清HBsAg、抗．HBs水平，熒光定量PCR檢測(cè)血清HBV DNA滴度，常規(guī)生化法檢測(cè)血清ALT水平。病理切片常規(guī)HE染色分析肝臟及其它多個(gè)臟器的炎癥情況，免疫組化分析肝組織HBsAg和HBeAg的表達(dá)。蛋白印跡檢測(cè)MAPK與P13K／Akt兩條細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)與磷酸化水平。 研究結(jié)果：1.免疫后2周，DC／Ad-S

10、-SeFv組比DC／Ad-S、DC／Ad-ScFv、pcDNA3.1-S及anti-PD-L1組誘導(dǎo)HBsAg特異性CD8+T細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ的能力顯著增強(qiáng)，且能誘導(dǎo)更強(qiáng)的HBsAg特異性CTL應(yīng)答。而與其余各組相比，DC／Ad．S組誘導(dǎo)CD8+T細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ和HBsAg特異性CTL應(yīng)答的能力也明顯增強(qiáng)。 2.免疫后4周，DC／Ad-S-ScFv組比DC／Ad-S、DC／Ad-ScFv、pcDNA3.1-S及anti-P

11、D-L1組誘導(dǎo)HBsAg特異性CD8+T細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ，以及CTL應(yīng)答的能力仍強(qiáng)。而與其余各組相比，DC／Ad．S組誘導(dǎo)產(chǎn)生IFN-γ和HBsAg特異性CTL應(yīng)答的能力無顯著性差異。 3.DC／Ad-S-ScFv組免疫后2周和4周，誘導(dǎo)Tc產(chǎn)生IFN-γ能力及CTL反應(yīng)差異均不明顯，但免疫后8周時(shí)均明顯減弱。而DC／Ad-S免疫后4周與2周時(shí)相比，其CTL反應(yīng)及IFN-γ,水平明顯減弱，免疫后8周時(shí)已處于較低水平，且明顯低于

12、此時(shí)的DC／Ad-S-SeFv組水平。 4.Tg鼠血清HBsAg表達(dá)抑制作用最強(qiáng)的為DC／AdoS-ScFv組，尤其是免疫后4周。而DC／Ad-S組免疫后4周對(duì)HBsAg的抑制已經(jīng)下降，即存在血清HBsAg水平的回升，pcDNA3.1(+)-S組在免疫后1～4周抑制HBsAg的作用不強(qiáng)但平穩(wěn)。 5.免疫后2周，DC/Ad-S-SeFv組血清HBV DNA水平迅速下降，且顯著低于DC／Ad-S組和pcDNA3.1(+)-S

13、組。免疫后4周，Ad-S-SeFv組血清HBV DNA水平仍較低，且明顯低于DC／Ad-S組和pcDNA3.1(+)-S組。各組在免疫后8周的血清HBV DNA水平均有反彈，且各組間比較的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 6.免疫后2周，DC／Ad．S．SeFv組，pcDNA3.1(+)．其余各組的抗體水平均較低。除pcDNA3.1(+)-S組外，所有血清樣本抗體水平在免疫后4周均未達(dá)10 mIU／ml以上。 7.免疫后2周和4周的各

14、組血清ALT有輕度增高，但組間差異不明顯。免疫后2.8周，除DC／Ad-S-ScFv、DC／Ad-S組部分Tg鼠肝實(shí)質(zhì)有較明顯的局部炎癥浸潤(rùn)外，其余各組的炎癥浸潤(rùn)情況多不明顯。免疫后第2周和第4周，DC／Ad-S-ScFv組Tg鼠的心肌、胃粘膜、小腸、腎臟及肺組織均未發(fā)生自身免疫炎癥反應(yīng)。 8.肝臟免疫組化結(jié)果表明，未免疫和PBS對(duì)照組Tg鼠肝組織HBcAg表達(dá)強(qiáng)陽性，DC／Ad-S-ScFv組在免疫后2-8周有8例肝臟HBcA

15、g表達(dá)弱陽性；DC／Ad-S組有6例肝臟HBcAg表達(dá)弱陽性；而DC／Ad-ScFv、pcDNA3.1(+)-S、anti-PD-L1注射組和DC對(duì)照組分別有3例、3例、1例和1例HBcAg表達(dá)弱陽性。 9.肝臟免疫組化結(jié)果表明，未免疫和PBS對(duì)照組Tg鼠肝組織HBsAg表達(dá)強(qiáng)陽性；DC／Ad-S-ScFv組在免疫后2-8周有7例HBsAg表達(dá)弱陽性DC／Ad-S有5例HBsAg表達(dá)弱陽性；而pcDNA3.1(+)-s、DC／A

16、d-ScFv和DC對(duì)照組分別有3例、2例和l例HBsAg表達(dá)弱陽性。 10.肝組織蛋白印跡表明，DC／Ad-S-ScFv組的MAPK通路的Erk1／2磷酸化水平明顯高于其它各組，而Akt蛋白的磷酸化水平在各組間無顯著性差異。 研究結(jié)論： 1.DC／Ad-S-SeFv能誘導(dǎo)比DC／Ad-S或DNA疫苗更強(qiáng)的I型免疫應(yīng)答和特異性CTL免疫效應(yīng)，對(duì)HBV Tg小鼠血清HBsAg、HBV DNA水平和肝臟組織HBcAg和

17、HBsAg的表達(dá)有較迅速和明顯的抑制作用，且未引起免疫小鼠的自身免疫炎癥反應(yīng)。 2.DC／Ad-S-ScFv誘導(dǎo)血清抗-HBs的作用仍不強(qiáng)，但在免疫后2周時(shí)明顯強(qiáng)于Ad-S轉(zhuǎn)導(dǎo)的DC，且與pcDNA3.1(+)-8質(zhì)粒疫苗的效果相當(dāng)。 3.DC／Ad-S-ScFv免疫小鼠肝組織蛋白印跡表明，MAPK途徑的Erk1／2蛋白磷酸化水平明顯增強(qiáng)，提示其進(jìn)一步激活了TCR下游細(xì)胞增殖相關(guān)信號(hào)通路。 4.DC／Ad-S-S