一種鼠源抗CTLA4單鏈抗體mS的構(gòu)建及制備.pdf

1、免疫抑制劑在臨床上的廣泛應(yīng)用是二十世紀(jì)器官移植領(lǐng)域取得的重大突破性進(jìn)展之一。免疫抑制劑的廣泛應(yīng)用在大規(guī)模降低急性排斥反應(yīng)發(fā)生率的同時，也引起了長期蓄積的毒副作用，從而導(dǎo)致移植器官的損傷，制約了病人或供器官長期存活率的進(jìn)一步提高。已有研究表明，活化T細(xì)胞是介導(dǎo)移植排斥的重要細(xì)胞，選擇性清除活化T細(xì)胞而保留靜息T細(xì)胞，能控制移植排斥反應(yīng)發(fā)生，減少藥物的毒副作用。 活化的 T 細(xì)胞表面會誘導(dǎo)表達(dá)細(xì)胞毒性 T 淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原4(CTL

2、A4)分子，基于識別CTLA4分子而殺傷活化 T 細(xì)胞的免疫毒素可以特異性殺傷活化T細(xì)胞而保留靜息T細(xì)胞。作為免疫毒素關(guān)鍵的導(dǎo)向分子決定著目標(biāo)分子的識別，詳細(xì)探討導(dǎo)向分子的功能對構(gòu)建免疫毒素非常必要?；诖?，本文設(shè)計鼠源anti-cTLA-4單鏈抗體(scFv)(簡稱mS)，用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)該單鏈抗體，初步探索其功能，結(jié)果如下： 以裝載了鼠源Anti-cTLA-4-scFv基因的PBMN質(zhì)粒為模板，根據(jù)鼠源Anti-CTL

3、A-4-scFv的基因序列設(shè)計引物，在引物設(shè)計時引入相關(guān)雙酶切位點(BamtI/Kpn I)，PCR擴(kuò)增獲得單鏈抗體基因，再克隆到pQE30載體，提取pQE30-mS質(zhì)粒，轉(zhuǎn)入大腸桿菌中表達(dá)，提取表達(dá)產(chǎn)物發(fā)現(xiàn)蛋白mS絕大部分以包涵體形式表達(dá)，占細(xì)菌總蛋白量30％，極少量以可溶分子形式存在?？扇懿糠纸?jīng)親和層析純化后，純度僅能達(dá)到50[％]且表達(dá)量僅為mS總蛋白量的1[％]。包涵體經(jīng)洗滌緩沖液洗滌后，純度可達(dá)75[％]。洗滌后包涵體經(jīng)8mo

4、l／L尿素溶解，變性條件pH值7.5下DEAE柱層析吸附雜蛋白，mS純度提高到95％以上。 經(jīng)純化后變性mS在復(fù)性緩沖液(50mmol／L Tris，pH8.0，20mmol／lNaCI,0.8mmol/L KCI，lmmol/L EDTA，2mmol/L GSH，0.2mmol/LGSSH，1mol/LUrea，0.8mol/LL-Arginine)中4℃透析復(fù)性48h，獲得可溶蛋白。 以人臍靜脈細(xì)胞株ECV-304為

5、陰性對照細(xì)胞，以小鼠淋巴瘤細(xì)胞株EL4為陽性對照建立細(xì)胞模型，檢測復(fù)性后可溶mS功能。以Hanks buffer為空白對照，間接細(xì)胞ELISA法測定mS與細(xì)胞的結(jié)合活性。結(jié)果顯示mS具有高特異性，具有與CTLA-4陽性細(xì)胞EL4細(xì)胞特異性結(jié)合的功能，結(jié)合率是陰性細(xì)胞ECV-304細(xì)胞的3倍。 本論文的研究表明，成功構(gòu)建、表達(dá)的鼠源抗CTLA4單鏈抗體分子mS具有高特異性，能特異性結(jié)合CTLA-4陽性表達(dá)細(xì)胞?；诖隧椦芯拷Y(jié)果，后