土撥鼠CTLA-4胞外段與HBc融合DNA疫苗的構建、真核表達和小鼠免疫.pdf

1、目的構建一個新的土撥鼠細胞毒性T淋巴細胞相關蛋白-4(wCTLA-4)胞外部分和人乙型肝炎病毒核心蛋白(HBc)融合蛋白的表達質粒pwCTLA-4-HBc，并檢測其編碼的融合蛋白在真核細胞中的表達和分泌情況，初步鑒定其在小鼠體內誘導相應抗體生成的情況。為揭示其作用機制和進一步用于慢性患者免疫治療奠定基礎。 方法以德國埃森大學醫(yī)學院病毒所構建的表達wCTLA-4與全長土撥鼠嗜肝病毒核心抗原(WHc)融合蛋白的質粒pCTLA-4-C

2、為模板，通過PCR獲得wCTLA-4胞外段和WHc前149位氨基酸融合蛋白編碼基因片段。pcDNA3.1/V5-HIS(C)TOPO(R)TA表達載體克隆獲得帶有V5-HIS標簽的表達質粒pwCTLA-4-WHc。經酶切鑒定和轉染幼倉鼠腎(BHK)細胞，間接免疫熒光方法檢測融合蛋白表達，證實其構建成功。根據設計的酶切位點，將其與含人乙型肝炎病毒核心抗原全長基因片段(HBc)的質粒pHcex同時雙酶切，然后T4連接酶連接，以HBc基因片段

3、置換pwCTLA-4-WHc質粒中的WHc片段。經雙酶切鑒定插入片段大小方向正確，得到含土撥鼠CTLA-4蛋白胞外部分和HBc編碼序列的帶有V5-HIS標簽的表達質粒pwCTLA-4-HBc。該質粒轉染BHK細胞，間接免疫熒光方法(IF)檢測融合蛋白的表達。轉染人宮頸癌(Hela)細胞，細胞經溫和裂解后收集上清與直接收集的細胞培養(yǎng)上清同時以化學發(fā)光微粒免疫法(CMIA)檢測融合蛋白的表達。純化質粒肌肉注射BALB/cJ(H-2d)小鼠雙

4、側后肢脛前肌，共免疫三次。最后一次免疫3周后，眼眶靜脈取血，分離血清，使用Enzygonost(R)抗-HBc/抗-HBe單克隆抗體試劑盒檢測篩查免疫小鼠抗-HBc/抗-HBe抗體陽性率。 結果融合蛋白重組質粒pwCTLA-4-HBc經雙酶切后均可獲得預期大小片段，重組體轉染的BHK細胞可檢測到HBc抗原特異性免疫熒光，pwCTLA-4-HBc轉染Hela細胞后細胞裂解液和培養(yǎng)上清中針對HBeAg的CMIA反應呈強陽性，其中培養(yǎng)

5、上清中抗原的相對濃度為細胞裂解液中的10倍。3次免疫結束后第二周末，wCTLA-4-HBc融合蛋白表達質粒免疫組4只動物中，有2只產生了針對HBcAg特異性的抗體(抗-HBc陽性率50％)，其中一只的血清也可檢測到抗-HBe(抗-HBe陽性率25％)。 結論成功構建wCTLA-4胞外段和HBc融合蛋白表達質粒pwCTLA-4-HBc；wCTLA-4-HBc融合蛋白可以在脂質體介導下在真核細胞表達并可大量分泌到細胞外培養(yǎng)上清中；表