Human Neurotrophin-3綠色熒光表達(dá)載體的構(gòu)建及真核表達(dá).pdf

1、目的：Neurotrophin-3(NT-3)是神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)素(Neurotrophins)家族的重要成員。NT-3能促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞的存活、增殖和突觸的生長(zhǎng)，對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)的損傷能起到保護(hù)作用?；蚬こ躺a(chǎn)的NT-3有利于對(duì)其生物學(xué)功能進(jìn)行研究，并且在治療神經(jīng)系統(tǒng)損傷中將發(fā)揮重要作用。本實(shí)驗(yàn)?zāi)康脑谟谕ㄟ^(guò)分子生物學(xué)手段構(gòu)建人神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子-3(Human Neurotrophin-3，hNT-3)綠色熒光真核表達(dá)載體，達(dá)到在表達(dá)NT-3的同時(shí)，實(shí)時(shí)地

2、監(jiān)測(cè)到它表達(dá)之目的。從而方便于對(duì)NT-3功能的研究和對(duì)其進(jìn)行神經(jīng)系統(tǒng)損傷性疾病治療效果的分析。 此外，本實(shí)驗(yàn)還對(duì)人NT-3基因進(jìn)行突變，為更深入地研究NT-3的結(jié)構(gòu)、功能及作用機(jī)制打下基礎(chǔ)。 在以綠色熒光蛋白載體表達(dá)NT-3時(shí)，為了更準(zhǔn)確地說(shuō)明NT-3對(duì)真核細(xì)胞的作用，需要對(duì)綠色熒光表達(dá)載體pEGFP-N1對(duì)真核細(xì)胞的生物學(xué)特性是否存在影響有所了解。因此，我們研究了轉(zhuǎn)染增強(qiáng)型綠色熒光蛋白表達(dá)載體pEGFP-N1對(duì)C6

3、細(xì)胞的增殖性、細(xì)胞活力、細(xì)胞周期等生物學(xué)特征的影響。 方法：根據(jù)Maisonpierre等人提交的序列設(shè)計(jì)引物，并在引物中加上限制性內(nèi)切酶EcoR I和BamH I的識(shí)別序列。以正常人外周血基因組DNA為模板，保真PCR擴(kuò)增NT-3片段。EcoR I、BamH 1分別雙酶切PCR產(chǎn)物和綠色熒光表達(dá)載體pEGFP-N1，通過(guò)T4 DNA Ligase將PCR產(chǎn)物連接入pEGFP-N1，從而構(gòu)建NT-3綠色熒光真核表達(dá)載體p

4、EGFP-NT3。測(cè)序分析NT-3克隆情況和綠色熒光表達(dá)載體pEGFP-NT3構(gòu)建情況。脂質(zhì)體包裹重組質(zhì)粒pEGFP-NT3，轉(zhuǎn)染SD大鼠間充質(zhì)細(xì)胞和293T細(xì)胞。脂質(zhì)體包裹質(zhì)粒pEGFP-N1轉(zhuǎn)染C6細(xì)胞，經(jīng)G418篩選，得到穩(wěn)定表達(dá)綠色熒光的C6-EGFP細(xì)胞。細(xì)胞計(jì)數(shù)、MTT實(shí)驗(yàn)、流式細(xì)胞術(shù)分別測(cè)定C6細(xì)胞在轉(zhuǎn)染綠色熒光蛋白前后增殖性，細(xì)胞活力以及細(xì)胞周期等生物學(xué)特性。 易錯(cuò)PCR(Error Prone PCR，EPP

5、CR)能在目的基因片段內(nèi)隨機(jī)引入突變。采用通常在PCR擴(kuò)增中容易引起突變的保真性較低的Taq酶，在PCR過(guò)程中產(chǎn)生hNT-3的突變，并將其克隆到T載體中。 結(jié)果：本實(shí)驗(yàn)克隆的NT-3序列與Maisonpierre等人提交的序列完全一致，構(gòu)建的重組質(zhì)粒pEGFP-NT3能夠?qū)崿F(xiàn)NT-3和增強(qiáng)型綠色熒光蛋白融合表達(dá)。在轉(zhuǎn)染了pEGFP-NT3的SD大鼠間充質(zhì)細(xì)胞和293T細(xì)胞中觀察到了綠色熒光。達(dá)到了利用綠色熒光蛋白檢測(cè)NT-3在