高糖通過下調(diào)腎小管上皮細胞PTEN表達促進纖維化病變的機制及藥物干預(yù)研究.pdf

1、目的：本研究旨在觀察高糖對腎小管上皮細胞PTEN和PI3K/Akt信號通路以及EMT相關(guān)指標(biāo)蛋白的表達變化的影響，同時進一步探討洛伐他汀對高糖培養(yǎng)的腎小管上皮細胞中PTEN和PI3K/Akt信號通路表達變化的影響及在腎小管纖維化病變中的作用及可能機制。
　　方法:培養(yǎng)大鼠腎小管上皮細胞(NRK52E)，應(yīng)用免疫酶細胞化學(xué)、免疫熒光細胞化學(xué)檢測上皮細胞標(biāo)志性蛋白角蛋白 CK-18、鈣黏蛋白(E-cadherin)和間質(zhì)細胞標(biāo)志性蛋白

2、α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)鑒定所培養(yǎng)細胞；MTT實驗檢測洛伐他汀對NRK52E生長活性的影響。細胞傳代后隨機分三組：(1)正常糖(NG)對照組：2％ FBS+DMEM(含糖5.5 mmol/L)培養(yǎng)；(2)高糖(HG)組：2%FBS+19.5mmol/L D-glucose+DMEM(含糖5.5 mmol/L)培養(yǎng)；(3)高糖+洛伐他汀(HR)組：2% FBS++19.5mmol/L D-glucose+DMEM(含糖5.5 mm

3、ol/L)+洛伐他汀(10uM)培養(yǎng)，各組細胞分別培養(yǎng)2h,12h,24h和48h四個時間點后收集蛋白和RNA進行觀察；Western blotting檢測各組腎小管上皮細胞中PTEN、p-Akt(ser473)、E-cadherin、α-SMA和膠原蛋白Ⅳ(CollagenⅣ，Col-Ⅳ)蛋白表達；Real-time PCR技術(shù)檢測PTEN mRNA的表達。
　　結(jié)果:
　　(1)細胞鑒定結(jié)果顯示為腎小管上皮細。
　

4、　(2)MTT實驗結(jié)果顯示0-50uM濃度的洛伐他汀對細胞生長無明顯影響，根據(jù)參考文獻及MTT實驗結(jié)果選定適合濃度(10uM)對細胞進行干預(yù)。
　?。?）與NG組比較，HG處理12h、24h和48h時PTEN mRNA及蛋白表達明顯減少，并隨 HG處理時間的延長為進行性減少，p-Akt(ser473)蛋白表達明顯增多，E-cadherin蛋白表達減少，α-SMA蛋白表達顯著增多，Col-Ⅳ沉積增多；予以洛伐他汀干預(yù)后，與高糖組比較