益腎緩衰方對(duì)腎小管間質(zhì)纖維化的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、背景:腎小管間質(zhì)纖維化(renal tubulointerstitial fibrosis TIF)是各種腎臟疾病進(jìn)展至終末期腎病的共同表現(xiàn)和主要病理基礎(chǔ),是腎功能衰竭的共同途徑[1]。它是以腎小管上皮細(xì)胞變性、萎縮、消失,間質(zhì)中淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞浸潤(rùn)、同時(shí)聚集大量的肌成纖維細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)為主要特征[2]。在二十世紀(jì)的漫長(zhǎng)歲月罩人們對(duì)腎臟疾病的研究中,對(duì)腎小球疾病的認(rèn)識(shí)相對(duì)較深入,而對(duì)腎小管間質(zhì)病理改變的研究相對(duì)較少,甚至是忽略掉的。

2、自上世紀(jì)九十年代,Risdon等首次發(fā)現(xiàn)腎小球?yàn)V過率(GFR)的下降與腎小管萎縮呈正相關(guān),而與腎小球損害無明顯相關(guān)性以來,越來越多的研究表明,腎功能損害與腎小管間質(zhì)病理改變的程度密切相關(guān)[3]。在終末期腎病(ESRD)患者中腎小管間質(zhì)疾病為原發(fā)病的占到20％-30％,而在各種常見的腎小球疾病發(fā)展的不同階段都合并有不同程度的腎小管間質(zhì)的損傷。有大量臨床和試驗(yàn)研究表明,腎小管間質(zhì)損害程度與腎功能的相關(guān)性比腎小球病變更為密切,是反映腎功能下降

3、嚴(yán)重程度及判斷預(yù)后最重要的指標(biāo)[4]。我們可以認(rèn)為在CKD進(jìn)展過程中,腎小管間質(zhì)損傷起著比腎小球病變更為重要的作用,并決定著CKD的預(yù)后和轉(zhuǎn)歸[5]。因此,探討腎間質(zhì)纖維化的形成機(jī)制及防治措施,在臨床上尋找能阻止或減緩腎間質(zhì)纖維化的藥物具有重要意義。益腎緩衰方作為我院院內(nèi)制劑用于慢性腎衰竭治療已近二十年,并取得了良好的臨床療效。主要藥物組成有生黃芪、人參、當(dāng)歸、川芎、赤芍、茯苓、雞血藤、熟大黃等,是具益氣養(yǎng)血活血、利濕瀉濁之功的中藥復(fù)方

4、。我科已往的研究工作證實(shí)該藥能減輕5/6腎切除造模大鼠殘余腎ECM的積聚,抑制促纖維化因子TGF—β在殘余腎表達(dá),改善腎小球硬化和抑制小管-間質(zhì)纖維化程度[6]。在緩衰方對(duì)5/6腎切除大鼠腎內(nèi)微血管重塑及血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)表達(dá)影響的研究中證實(shí),緩衰方與血管緊張素轉(zhuǎn)換酶受體拮抗劑(科素亞)均有促進(jìn)殘余腎內(nèi)VEGF表達(dá),減輕腎內(nèi)微血管丟失以及減輕腎纖維化程度的作用。通過益腎緩衰方治療46例慢性馬兜鈴酸腎病臨床觀察研究我們發(fā)現(xiàn),此方

5、可明顯延緩慢性馬兜鈴酸腎病患者腎功能進(jìn)行性減退的速度。[7]而在通過對(duì)腎活檢的腎小管間質(zhì)損傷較明顯的78名CKD患者的觀察,收集相關(guān)實(shí)驗(yàn)室檢查指標(biāo),腎臟病理資料,結(jié)合中醫(yī)臨床資料進(jìn)行分析,我們得出如下結(jié)論:(1)CKD患者血瘀證與腎小管間質(zhì)損傷存在顯著相關(guān)性,血瘀證可能是CKD患者中醫(yī)證候因素中影響CKD進(jìn)展的關(guān)鍵因素。(2)濕熱證與血瘀證之間存在密切聯(lián)系,“濕熱夾瘀”是CKD患者中醫(yī)證候的重要內(nèi)容。(3)在CKD患者濕熱證、血瘀證可能

6、是影響CKD進(jìn)展的重要因素。這一有關(guān)腎小管間質(zhì)纖維化的證型研究,為本次實(shí)驗(yàn)選用益氣養(yǎng)血活血,利濕瀉濁之功的益腎緩衰方提供了堅(jiān)實(shí)依據(jù),為進(jìn)一步闡明中醫(yī)藥在腎小管間質(zhì)損傷中的作用提供了重要的理論基礎(chǔ)。
　　 目的:本研究通過對(duì)服用本院制劑益腎緩衰方、厄貝沙坦及動(dòng)物無菌飲用水的單側(cè)輸尿管結(jié)扎(UUO)大鼠模型各組的腎臟纖維化程度的研究,以明確本院制劑益腎緩衰方在延緩腎間質(zhì)纖維化及保護(hù)腎功能中的作用。通過利用UUO大鼠小管間質(zhì)損傷模型,

7、觀察藥物對(duì)大鼠血液生化指標(biāo)的影響,組織病理損害的程度,采用免疫組化法檢測(cè)大鼠腎臟組織中α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α—SMA),骨形態(tài)形成蛋白-7(BMP-7)的表達(dá),探索這兩者的相關(guān)機(jī)制和聯(lián)系性,探討益腎緩衰方是否能通過調(diào)節(jié)α—SMA及BMP-7的表達(dá),從而達(dá)到減輕腎臟病理變化,改善腎功能的作用。探討益氣活血利濕法在腎小管間質(zhì)纖維化中的防治作用及中醫(yī)藥在腎小管間質(zhì)纖維化中的積極作用,為臨床上CKD患者的治療提供可推廣的有效藥物與相應(yīng)的診療思路

8、。
　　 方法:本實(shí)驗(yàn)以180—200g健康雄性Wister大鼠(解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院提供)為研究對(duì)象,動(dòng)物適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后,將32只大鼠隨機(jī)分為四組,每組8只:假手術(shù)組,模型組,中藥組,厄貝沙坦組。其中模型組,中藥組及厄貝沙坦組造UUO大鼠模型:均用10％水合氯醛(2.0～3.0ml/kg)腹腔注射麻醉,手術(shù)野去毛,75％乙醇消毒,選擇腹正中線切口稍偏左,依次切開皮膚至腹腔,游離腎臟及輸尿管,將左側(cè)輸尿管用組織鉗托起中段部位,

9、止血鉗夾住,在兩端用4—0絲線結(jié)扎左側(cè)輸尿管近腎盂段及遠(yuǎn)端,然后連續(xù)縫合皮膚。[8]假手術(shù)組手術(shù)入路方式同模型組,但打開腹腔后游離輸尿管不結(jié)扎,即縫合皮膚。模型組予動(dòng)物無菌飲用水12ml/kg.d,假手術(shù)組予動(dòng)物無菌飲用水12ml/kg.d,中藥組:予中藥藥液12ml/kg.d(用藥量相當(dāng)于成人每天每公斤體重的15倍)厄貝沙坦組予1mg/ml濃度厄貝沙坦溶液(無菌飲用水每日現(xiàn)配),12ml/kg.d,各組均連續(xù)灌胃10天,日一次。術(shù)后第

10、10d處死各組大鼠,從股動(dòng)脈采血,分離血清,測(cè)定血肌酐(Scr),尿素氮(BUN)。剖取左側(cè)腎臟原位灌洗,用10％甲醛固定,石蠟包埋,以2um厚切片,行常規(guī)HE染色,以了解各組病理改變情況,行Masson染色,用顯微鏡圖像分析儀(Olympus ix70倒置熒光顯微鏡)及Imagepruplus圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行分析,陽性面積(μm2)作為統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù),評(píng)定各組腎小管間質(zhì)損害程度。最終結(jié)果采用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行相關(guān)分析。
　　 結(jié)果

11、:
　　 (1)腎功能測(cè)定:與假手術(shù)組相比較,其余三組Scr均明顯升高(P<0.05),經(jīng)中藥及厄貝沙坦治療后,下降不明顯(P>0.05)。而BUN檢測(cè)顯示,與假手術(shù)組比較,其余三組BUN均明顯上升(P<0.05),但與模型組比較,中藥組與厄貝沙坦組均有明顯下降(P<0.05),兩治療組之間比較,無明顯差別。(P>0.05)。即經(jīng)過治療后,對(duì)Scr影響不明顯,對(duì)BUN有較明顯的影響,但未降至正常水平。
　　 (2)腎臟病

12、理:肉眼觀察可見:假手術(shù)組大鼠腎臟顏色暗紅,大小形態(tài)正常。模型組,中藥組及厄貝沙坦組大鼠結(jié)扎側(cè)腎臟顏色淡,腫大明顯,有囊性感,內(nèi)存黃褐色混濁液體,腎盂明顯擴(kuò)張,實(shí)質(zhì)變薄。光鏡下可見:①HE染色,假手術(shù)組偶見。腎小管上皮細(xì)胞空泡變性,灶狀單核細(xì)胞浸潤(rùn)；模型組可見彌漫的。腎小管上皮細(xì)胞空泡變性,部分管腔內(nèi)有蛋白或細(xì)胞管型,灶狀小管擴(kuò)張、萎縮,偶見壞死,腎間質(zhì)有多灶狀單核細(xì)胞浸潤(rùn)和纖維化,腎小球無明顯病理變化。中藥組及厄貝沙坦組上述改變均有所

13、減輕。②Masson染色,模型組可見間質(zhì)大量藍(lán)染膠原纖維增生,腎小球病變不明顯。中藥組,厄貝沙坦組腎間質(zhì)膠原纖維陽性染色面積較模型組均明顯下降(P<0.01),兩治療組間比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。
　　 (3)腎臟中α-SMA、BMP-7的表達(dá)及變化:α-SMA在各組中的表達(dá):假手術(shù)組的血管壁平滑肌細(xì)胞呈強(qiáng)陽性表達(dá),腎小球和腎小管上皮細(xì)胞無明顯著色,腎髓質(zhì)稀疏散在分布呈弱陽性。模型組表達(dá)部位以腎間質(zhì)為主,主要圍繞在

14、萎縮或擴(kuò)張的腎小管周圍,或纖維化的腎間質(zhì)中。中藥組和厄貝沙坦組可見散在于纖維化的腎間質(zhì)處有少量表達(dá)；BMP-7在各組中的表達(dá):假手術(shù)組大鼠腎臟在遠(yuǎn)曲小管、集合管均有表達(dá),且表達(dá)較強(qiáng)烈,在近端小管上皮細(xì)胞有少量表達(dá),在腎小球內(nèi)基本無表達(dá)。在髓質(zhì)區(qū)表達(dá)明顯高于在皮質(zhì)區(qū)的表達(dá)。模型組大鼠腎間質(zhì)纖維化程度加重,BMP-7表達(dá)明顯減少；中藥組和厄貝沙坦組大鼠。腎臟BMP-7表達(dá)量均較模型組明顯增加,較假手術(shù)組減少。
　　 結(jié)論:
　

15、　 1.益腎緩衰方可明顯降低血清尿素氮含量,效果與厄貝沙坦無明顯差別。但無明顯降低肌酐作用,厄貝沙坦亦相同。
　　 2.益腎緩衰方與厄貝沙坦均可抑制α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)的表達(dá),增加骨形態(tài)形成蛋白-7(BMP-7)在UUO大鼠腎臟組織中的表達(dá),抑制了腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化,增加了ECM的降解,且兩治療組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,說明益腎緩衰方治療效果與厄貝沙坦相似,均有減輕腎臟纖維化作用。
　　 3.益腎緩衰方組與模

16、型組比較,α—SMA的陽性表達(dá)面積、Masson染色的膠原纖維面積均減少,證實(shí)益腎緩衰方減少了增生的ECM成分,減輕腎臟纖維化的病變程度。
　　 4.在腎小管間質(zhì)纖維化過程中,腎間質(zhì)纖維化面積與BUN、Scr均呈正相關(guān)(r=0.637,P<0.001),提示腎功能損害與間質(zhì)纖維化程度相關(guān),與α-SMA的表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.845,P<0.001),與BMP-7的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.865,P<0.001),α-SMA與BM