配子與胚胎冷凍保存、胚胎移植、性別控制

1、第五部分 胚胎生物技術(shù)四、配子與胚胎冷凍保存五、胚胎移植六、性別控制,配子與胚胎冷凍保存,概念：配子與胚胎冷凍是指采用抗凍保護(hù)劑對配子或胚胎進(jìn)行脫水處理，再經(jīng)過降溫程序使胚胎最終在-196℃條件下停止代謝活動，條件適宜時解凍并使其恢復(fù)活力的技術(shù)。 意義：建立配子庫、胚胎庫；保護(hù)生物多樣性和珍惜瀕危動物遺傳資源；遺傳資源及動物模型的國際范圍內(nèi)運輸；避免運輸過程中攜帶細(xì)菌或病毒。,原理：細(xì)胞代謝活動與溫度

2、脫水過程抗凍保護(hù)劑冰晶與抗凍保護(hù)劑毒性/滲透壓打擊之間的平衡,細(xì)胞代謝活動與溫度： 配子及胚胎的自身活力和代謝活動直接受溫度變化的影響，當(dāng)處于超低溫（-196攝氏度）時，代謝活動完全停止，處于靜止?fàn)顟B(tài)，當(dāng)在適宜條件下溫度升高后又可以恢復(fù)活性。 脫水過程： 配子或胚胎冷凍保存事實上是一個脫水過程，當(dāng)配子或胚胎處于高滲溶液中，細(xì)胞內(nèi)的水分通過細(xì)胞膜外流，當(dāng)環(huán)境滲透壓足夠大或胚胎暴露

3、時間足夠長時，細(xì)胞內(nèi)的水分充分外流，從而在冷凍過程中避免或減少冰晶的形成。,抗凍保護(hù)劑： 通常在冷凍液中添加抗凍保護(hù)劑形成高滲，細(xì)胞內(nèi)水分外流的同時，抗凍保護(hù)劑內(nèi)流至配子或胚胎細(xì)胞內(nèi)，抗凍劑存在使溶液的冰點降低，使胚胎有更多的時間把細(xì)胞內(nèi)的水分脫出，避免形成冰晶。但抗凍劑具有毒性，尤其在高濃度和高溫情況下毒性更大。 冰晶與抗凍保護(hù)劑毒性/滲透壓打擊之間的平衡： 冷凍過程中除了冰晶

4、、抗凍劑毒性外，還要考慮滲透壓打擊。因此冷凍成功與否就在于在冰晶和抗凍劑毒性和滲透壓打擊之間的平衡點。抗凍保護(hù)劑濃度越高、處理時間越長脫水越徹底，但毒性和滲透壓打擊越大。,抗凍保護(hù)劑的種類： 1、小分子滲透性抗凍保護(hù)劑 甘油、乙二醇、丙二醇、DMSO等 2、大分子非滲透性抗凍保護(hù)劑 蔗糖、聚蔗糖、棉子糖，麥芽糖，海藻糖等 3、卵黃（sperm）,冷凍保存及解凍方法,一、精液

5、 二、卵子或胚胎,一、精液冷凍： 小分子滲透冷凍保護(hù)劑（甘油）+卵黃，液氮蒸氣熏蒸或干冰冷凍,細(xì)管凍精,,顆粒凍精,,,,精液冷凍步驟：,采精 精液品質(zhì)檢查 精液的稀釋 精液保存,（一）、采精：定義：借助特定的器械將雄性的精液采集出來的技術(shù)。（一）假陰道法 Artificial vagina （牛、羊）（二）手握法和筒握法 A gloved hand （豬）（三）按摩法采精 Massage m

6、ethod （犬、雞）（四）電刺激采精法 Electroejaculation（野生動物和喪失交配能力但種用價值高的公畜）,（二）精液品質(zhì)鑒定： 1、外觀： 顏色： 一般為乳白色或灰白色。正常牛羊精液呈乳白色或乳黃色，豬、馬的精液呈淡乳白色或淺灰白色。,2、性狀：云霧狀 濃份精液因精子密度大、活力強，使精液翻騰呈現(xiàn)旋渦云霧狀。3、pH值： 牛、羊精液pH值為6.5-6.9, 豬、馬為 7

7、.4-7.5。一般同種精液pH值較低的品質(zhì)較好。4、雜質(zhì)： 如被毛、脫落上皮、炎性分泌物、灰塵、纖絲。,5、精子活率檢查 精子活率：在顯微鏡下觀察，在一個視野內(nèi)向直線前進(jìn)運動的精子占全部精子總數(shù)的百分率。?一般在37-38°C溫度下進(jìn)行評定，牛、羊精液尚需用生理鹽水作稀釋后才能評定。 ?活力一般用0-1.0的10級評分，一般新鮮采精液活率應(yīng)該為0.7~0.8左右。,6、精子密度的檢查

8、精子密度：是指單位體積（ml）精液內(nèi)所含有的精子數(shù)。,目測：在低倍顯微鏡下根據(jù)精子之間的距離來定，分為密、中和稀三等。,7、精子的形態(tài)檢查精子畸形率：頭部、頸部、尾部，觀察200個精子， 求出比例。用于輸精的精子畸形率不得超過20%。頭部：巨大，細(xì)小，缺失，雙頭，輪廓不明顯，皺縮頸部：臌大，纖細(xì)，彎曲，不全，原生質(zhì)滴尾部：屈折，帶原生質(zhì)滴，雙尾，折斷，纖細(xì),雙頭和雙尾精子,8、精子頂體異常率

9、頂體與精子受精能力直接有關(guān)，牛超過14%，豬超過4.3%，顯著降低受精率。,(三)、精液稀釋液,細(xì)管  A．一液：2.9％檸檬酸鈉液100.0mL，卵黃10.0mL。             二液：取一液41.75mL加果糖2.5g，甘油7.0mL。    &

10、#160;     B．脫脂牛奶83.0mL，卵黃10.0mL，甘油7.0mL。    顆粒  A．12.0％蔗糖液75.0mL，卵黃20.0mL，甘油5.0mL。          B．0.11％乳糖液75mL，卵黃20.0mL，甘油5.0mL。 &

11、#160;        C．2.9％檸檬酸鈉液73.0mL，卵黃20.0mL，甘油7.0mL。 D. Tris 3.44 g，檸檬酸1.83 g，果糖1.26 g，卵黃15%，甘油5%。    所有稀釋液每100.0mL中添加青、鏈霉素各10萬單位，現(xiàn)配現(xiàn)用。,精液稀釋方法,1、一次稀釋法：

12、 將采出的精液用含有甘油的同溫稀釋液按比例一次加入（常用于顆粒精液）。2、二次稀釋法： 將采出的精液用不含有甘油的常溫稀釋液一按精液品質(zhì)稀釋，放入4 ℃平衡，然后加入等溫的含甘油的第二液，加入量等于第一次稀釋的精液量（常用于細(xì)管精液）。,降溫和平衡（預(yù)冷）,稀釋后的精液，采用逐漸降溫法。在1～1.5小時內(nèi)，使稀釋精液的溫度降到4～5℃；然后再在同溫的恒溫容器內(nèi)平衡2～4小時。,,（四）、精液冷凍保存方法：

13、 1、顆粒精液 2、細(xì)管精液,顆粒凍精方法,所需器械：采用聚四氟乙烯板（簡稱氟板）、銅紗網(wǎng)、尼龍網(wǎng)或鋁板均可。 程序：在裝有液氮的容器上置一銅紗網(wǎng)，距液氮面２厘米左右，使溫度維持在-80℃至-100℃。將平衡后的精液用滴管按一定量（每毫升稀釋精液，滴凍10±1粒，滴管應(yīng)事先預(yù)冷 ）滴于銅紗網(wǎng)、滴完最后一滴，熏蒸３—５分鐘后，當(dāng)精液顆粒顏色變白時，立即浸入液氮，并將全部顆粒取下，收集于貯精瓶或紗網(wǎng)布袋

14、內(nèi)，并做好標(biāo)記，然后立即移入液氮罐中貯存。,,,細(xì)管凍精方法,所需儀器：細(xì)管灌封一體機（NFA-S1，富士平工業(yè)株式會社） 簡易方法：用1ml注射器（把200μL取樣槍頭從中間剪開，將尖頭部插入注射器頭部）將精液吸入0.25 mL的細(xì)管內(nèi)，管尾部留約1cm的空間，以備封口用，然后用PVC粉末封口，記號標(biāo)識。 冷凍程序：將裝好精液的細(xì)管裝入金屬架式網(wǎng)盒中，放入冷凍,在距離液氮上方5cm熏蒸15min后浸入液氮里保存

15、.,精液質(zhì)量控制（國標(biāo)）,1、劑量： a. 細(xì)管：中型0.5毫升；微型0.25毫升。　　 b. 顆粒：0.1±0.01毫升。　2、精子活力　　解凍后活力，指呈直線前進(jìn)運動的精子百分率（下限）30％（即0.3）；精子復(fù)蘇率（下限）50％?！?、 每一劑量解凍后呈直線前進(jìn)運動的精子數(shù)　　細(xì)管：每支（下限）1000萬個。　　顆粒：每粒（下限）1200萬個?！?、 解凍后的精子畸形率（上限）

16、20％?！?、 解凍后的精子頂體完整率（下限）40％?！?、 解凍后的精液無病原性微生物，每毫升中細(xì)菌菌落數(shù)（上限）1000個。 　7、 解凍后的精子存活時間　　在5～8℃貯存時（下限）為12小時；在37℃貯存時（下限）4小時?！　∨＠鋬鼍罕仨毞仙鲜龈黜椫笜?biāo)。否則，不得使用。,2、卵子或胚胎冷凍保存 小分子滲透冷凍保護(hù)劑+大分子非滲透性冷凍保護(hù)劑 程序冷凍 玻璃化冷凍,,,1、

17、冷凍胚胎的選擇： 用于冷凍保存的胚胎必須是形態(tài)良好的、發(fā)育正常 的高質(zhì)量胚胎，可以通過超數(shù)排卵及人工授精和體外受 精獲得。,2、程序冷凍： 1、10%甘油或乙二醇+0.25M Sucrose，程序降溫1℃/min，形成冰晶。 2、程序：抗凍保護(hù)劑的添加、程序降溫、植冰、解凍、 防凍劑的去除,冷凍保護(hù)劑的添加（程序化冷凍)：

18、 可采用多步法或一步法。胚胎移入冷凍保護(hù)液需平衡一段時間，以保證保護(hù)劑完全滲入細(xì)胞內(nèi)。平衡時間的長短視胚胎和冷凍保護(hù)劑滲透情況而定。冷凍前胚胎長期接觸保護(hù)劑會產(chǎn)生毒害作用，一般平衡時間10-30分鐘。,（牛冷凍液：PBS+20%FCS+10%甘油（乙二醇）+0.25M蔗糖）,胚胎裝管： 將平衡好的胚胎移入冷凍液中，然后將胚胎裝入冷凍管內(nèi)。,降溫程序：慢速冷凍：室溫 -7℃

19、 -30 ℃ 液氮 1℃/分 植冰 0.3 ℃/分,,,,冷凍速度   a. 在胚胎冷凍的早期研究中，大多采用慢速冷凍，以保證胚胎脫水充分，避免形成冰晶。 b.快速冷凍方法的建立使冷凍程序更為簡單、方便。,,3、玻璃化冷凍OPS(Open Pulled Straw)法：

20、 1）、35%-40%的抗凍保護(hù)劑（乙二醇、DMSO），迅速投入液氮，降溫速率3000℃/min，形成玻璃化狀態(tài)，不形成冰晶 。 2）、程序：抗凍保護(hù)劑的添加、快速降溫、解凍、防凍劑的去除,OPS法冷凍程序：VS1: TCM199+20%FCS+10%EG+10%DMSO (1分鐘)VS2: TCM199+20%FCS+20%EG+20%DMSO （25秒）39℃條件下完成。,將直徑為0.5m

21、m的毛細(xì)玻璃管(長9cm)或冷凍細(xì)管拉至直徑和管壁厚度均為原來的一半，從中間切斷。,4、 胚胎保存溫度 一般細(xì)胞長時間保存需要-130℃以下的溫度。液氮（-196℃）既可以滿足這一條件，且使用上安全方便。大量實驗證明，胚胎可以在液氮中保存多年。,5、 解凍和冷凍保護(hù)劑的去除 解凍：將胚胎從液氮中取出，通過一定程序恢復(fù)到室溫。 冷凍保護(hù)液為含有非滲透性冷凍保護(hù)劑的溶液，以避免滲透壓的迅速變

22、化對胚胎造成的損傷。解凍后的胚胎需在此液中停留一段時間以除去滲透性冷凍保護(hù)劑。,6、解凍和去保護(hù)劑過程 慢速解凍：20℃/分 快速解凍：360-500℃/分，30-37℃水浴 解凍時，將裝有胚胎的冷凍管從液氮罐中取出，在室溫下停留10秒，然后放入30℃水浴40秒，用消毒的干紗布擦凈管，剪斷細(xì)管兩頭，將胚胎和冷凍保護(hù)劑倒入解凍液中，6-7分鐘后移入培養(yǎng)液，洗滌3次后培養(yǎng)。（程序冷凍的解凍

23、方法）,從液氮中取出已凍存的OPS管，手指堵住OPS管尾，管尖端插入解凍液中，胚胎和冷凍液被轉(zhuǎn)移到解凍液1中，停留5min后轉(zhuǎn)入解凍液2，再停留5min，最后移入培養(yǎng)液，洗滌3次后培養(yǎng)。（OPS的解凍方法）,防凍劑去除過程也有多步法和一步法。常規(guī)冷凍法：PBS+20%FCS+0.25M蔗糖。OPS法：a. TCM199+20%FCS+0.3M蔗糖（5分鐘） b. TCM199+20%FCS+0.15

24、M蔗糖（5分鐘） 或直接進(jìn)入TCM199+20%FCS+0.25蔗糖中進(jìn)行移植。,第五部分 胚胎生物技術(shù)四、配子與胚胎冷凍保存五、胚胎移植六、性別控制,胚胎移植,手術(shù)法胚胎移植（小鼠、羊）非手術(shù)法的胚胎移植（牛）,家畜胚胎移植操作步驟,供、受體的選擇供體的超數(shù)排卵與人工授精受體的同期發(fā)情胚胎的收集胚胎的檢查和評定胚胎的移植,牛胚胎移植示意圖,牛非手術(shù)胚 胎移 植 示 意 圖,,所需器械：移植槍,1 、受體牛在

25、發(fā)情后6—8天之間均可進(jìn)行移植（發(fā)情之時定為0小時）。移植前對受體牛進(jìn)行直腸觸摸，檢查黃體是否合格。合格者用于移植。     2、 在移植之前必須先進(jìn)行尾椎硬膜外麻醉 ，擦拭外陰部。     3、 對照供體牛采胚記錄表和合格受體的發(fā)情記錄，合理地搭配受體和胚胎。     4、 解凍胚胎。     5、 重新將胚

26、胎裝入0.25ml塑料細(xì)管（直接解凍移植法不需要重新裝管）。     6、 細(xì)管裝入移植槍。     7、 把裝有細(xì)管的移植槍套上硬外套，用塑料環(huán)卡緊，再套上軟外套。     8、 將胚胎移植到受體黃體側(cè)的子宮角大彎處。     9、 做好受體移植記錄。,非手術(shù)法胚胎移植操作步驟（牛）,手術(shù)法移植（羊和小鼠）

27、 在受體腹部作一切口，找到排卵一側(cè)的卵巢并觀察黃體發(fā)育情況，然后用注射器或移植管將含有胚胎的培養(yǎng)液注入到子宮角內(nèi)或輸卵管內(nèi)。,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,超數(shù)排卵技術(shù),超排定義： 在母畜（供體）發(fā)情周期的某一時期，用外源性的促性腺激素處理，從而促使其卵巢上較正常有更多個卵泡同時發(fā)育，并且能夠同時或準(zhǔn)同時排出多個具有受精能力的卵子，這一技術(shù)稱為超數(shù)排卵，筒稱“超排”。,牛、羊有PG+FSH法和CIDR(

28、或海綿栓)+FSH法兩種；也有用PMSG.發(fā)情后9－13天開始；常用的激素為FSH；注射方法一般是連續(xù)4d遞減注射,每天2次,間隔12小時（半衰期短）；發(fā)情后8－12小時配種，間隔12小時再配種一次。,超數(shù)排卵方法：,（發(fā)情9～11天）FSH＋PG法牛超數(shù)排卵,早FSH1.5mg （國產(chǎn)，7.5mg/瓶） 晚FSH1.5mg,早FSH1.0mg 晚FS

29、H1.0mg,早FSH0.6mg + PGF2α4ml（0.4mg） 晚FSH0.6mg,早 FSH0.4mg 晚FSH0.4mg,24～48h發(fā)情后配種或輸精兩次，每隔6h輸一次(為0d)（細(xì)管：1000萬精子，顆粒1200萬精子）,第6～7d沖洗子宮（尾椎麻醉：鹽酸利度卡因100mg/5ml×2）,桑椹胚～早期囊胚,,,,,,,FSH＋CIDR＋PG法牛超排,發(fā)情周期任意一天

30、埋置CIDR,10d后取出CIDR，埋入第二個CIDR（為第0d）,第5d 早FSH 晚FSH,,第6d 早FSH 晚FSH,第7d 早FSH 晚FSH,第8d早 FSH＋PGF2α（取出CIDR，注PGF2α ） 晚FSH,24～48h發(fā)情，配種或輸精（為第0d）,第6～7d沖洗子宮，獲桑椹胚～早期囊胚,,,,,,,,*

31、澳大利亞產(chǎn)FSH總劑量306mg；日本產(chǎn)FSH24AU（量遞減）,PMSG法牛超數(shù)排卵,PGF2α消除黃體,發(fā)情第16～17d，注射PMSG1500～3000IU,隔日注射 hCG1000～1500IU,24～48h發(fā)情，配種或輸精（為第0d）,第6～7d沖洗子宮，獲得桑椹胚～早期囊胚,,,,,PMSG法牛超數(shù)排卵,FSH＋PG法羊超數(shù)排卵,早 FSH（國產(chǎn)，7.5mg/瓶） 晚FSH,早 FSH

32、 晚FSH,早 FSH + PGF2α2ml 晚FSH,24～48h發(fā)情，配種或輸精兩次（為第0d）,發(fā)情周期第12～13d（綿羊）、16～18d（山羊）,第6d沖洗子宮，獲得桑椹胚～早期囊胚,,,,,,同時靜脈注射LH100～150IU,,*國產(chǎn)FSH總量為150～300IU,FSH＋CIDR法羊超數(shù)排卵,發(fā)情周期任意1d陰道埋置CIDR （為

33、第1d）,第10d換第二個CIDR,第16、17、18d 早FSH 晚FSH,,第19d早 FSH（取出CIDR） 晚FSH,24～48h發(fā)情，配種或輸精（為第0d）,第6d沖洗子宮，獲桑椹胚～早期囊胚,,,,,,,第4d注射progcstin,*進(jìn)口FSH經(jīng)產(chǎn)羊總劑量7.04mg/只，育成羊5.28mg/只，等量注射,PMSG法羊超數(shù)排卵,發(fā)情周期的 12～13

34、d（綿羊）、 第16～18d（山羊）注射PMSG800～1500IU,24～48h發(fā)情，配種或輸精（為第0d）同時注射hCG500～750IU,第6d沖洗子宮，獲得桑椹胚～早期囊胚,,,,牛非手術(shù)法收集胚胎示意圖,不同發(fā)育階段的正常牛胚胎,發(fā)情后天數(shù),,發(fā)育階段,,桑椹胚~早期囊胚,性別決定與控制,性別決定原理性別鑒定技術(shù)性別控制技術(shù),哺乳動物性別控制原理 染色體性別決定：Y染色體決定雄性

35、 18世紀(jì)90年代，半翅目，精細(xì)胞觀察，一半精細(xì)胞多一段染色體。 1902年，Maclung提出模型：性別是由這一附加染色體決定的。這樣，性別也就在受精時由精子的染色體決定了。 1906年，Wilson稱這條染色體為X染色體，以后又在無X染色體的精母細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了一條更小的附加染色體，定名為Y染色體。 1959年，人和小鼠中發(fā)現(xiàn)了Y染色體與雄性決定相關(guān)。

36、 1966年，Y染色體短臂與雄性發(fā)育相關(guān)。 在Y染色體短臂上尋找TDF（Testis-determining factor），通過遺傳、生物化學(xué)、分子生物學(xué)，尤其是對突變體的分析和研究，使TDF的搜索范圍越來越小。 1989年，Palmer發(fā)現(xiàn)四位XX男性，擁有35-40kb的Y染色體特異性片段，將這一特異性片段經(jīng)數(shù)次重疊克隆酶切，制成了50個0.5-1.0kb的

37、小探針，分別與人、牛、小鼠等Y特異DNA進(jìn)行雜交，其中一個探針雜交成功，位于假常染色體區(qū)邊緣5kb處，命名為Y-染色體性別決定區(qū)（sex-determining region of Y chromosome, SRY）。,SRY基因在不同物種之間高度保守SRY就是TDF SRY表達(dá)與睪丸分化相關(guān)。 SRY轉(zhuǎn)基因小鼠（XX）表現(xiàn)為雄性發(fā)育和性行為。 XY女性的SRY突變分析。,,哺乳

38、動物性別鑒定技術(shù),1、性染色體分析鑒定胚胎性別(核型分析)2、X-連接酶法鑒定胚胎性別 （X染色體失活之前，XX胚胎的X-連接酶表達(dá)量是XY胚胎的二倍，如葡萄糖-6-磷酸脫氫酶或次黃嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶）3、H-Y抗原法鑒定胚胎性別（雄性特異）4、SRY-PCR法鑒定哺乳動物胚胎性別,,哺乳動物性別控制技術(shù),X、Y精子分離控制動物性別,X、Y精子分離方法,1、離心分離法：X精子的DNA含量比Y精子高，導(dǎo)致X精子的質(zhì)量

39、和密度大于Y精子，離心時X精子沉降速度比Y精子快。2、電泳分離法：根據(jù)X精子和Y精子表面電荷的差異，進(jìn)行分離，但結(jié)果不穩(wěn)定。3、免疫法：用適合的抗體與Y精子表面特有的H-Y抗原結(jié)合，使Y 精子失活而得到X精子。4、流式細(xì)胞分離法： X精子所含有DNA比Y精子多,流式細(xì)胞分離精子流程示意圖,流式細(xì)胞儀分離精子的原理,精子在Hoechest33342染色后，通過流式細(xì)胞儀時液流與激光交截，精子上的熒光染料Hoechest33342被氬

40、離子紫外激光（～350nm）激發(fā)，產(chǎn)生藍(lán)色激發(fā)光（～460nm）。由于X精子所含有DNA比Y精子多，其結(jié)合上的Hoechest33342就相對比較多，所激發(fā)出的熒光會比Y更強。熒光信號通過光電倍增管探測并轉(zhuǎn)變成電信號，傳遞給流式細(xì)胞儀的信息處理芯片，由它迅速根據(jù)DNA含量的差別分辨出哪個是X精子哪個是Y精子，處理得到的信息又迅速反饋回到液流上，使之充上正電荷或者負(fù)電荷。同時由于噴嘴產(chǎn)生高頻率的震動，噴射出的液柱也就形成一滴滴包含有X精子