康萊特注射液聯(lián)合吉非替尼對(duì)人肺腺癌NCi-H1975細(xì)胞株的作用研究.pdf

1、目的:如今肺癌的發(fā)病率已位于我國(guó)惡性腫瘤首位。由于肺癌的早期癥狀較為隱匿，確診時(shí)大多數(shù)病人已屬于晚期?；熓欠伟┲委煹幕?，但化療的不良反應(yīng)較大，且療效已達(dá)到平臺(tái)期，隨著分子靶向治療的出現(xiàn)，晚期非小細(xì)胞肺癌的治療也由傳統(tǒng)的化療轉(zhuǎn)向以基因分型為指導(dǎo)的分子靶向治療。其中應(yīng)用較多的是表皮生長(zhǎng)因子受體酪氨酸激酶抑制劑（EGFR-TKI）類藥物，如吉非替尼、厄洛替尼、?？颂婺岬取５S著EGFR-TKI類藥物的廣泛應(yīng)用耐藥問題也相應(yīng)產(chǎn)生，其中T79

2、0M突變約占EGFR-TKI耐藥的50％～60％。而我國(guó)傳統(tǒng)中醫(yī)藥在抗腫瘤治療中有其特殊功效，因此人們開始探索將傳統(tǒng)中藥與EGFR-TKI類藥物聯(lián)合應(yīng)用能否解決EGFR-TKI類藥物耐藥問題?？等R特注射液是一種以薏苡仁為主要成份的中藥，它對(duì)多種腫瘤細(xì)胞具有抗腫瘤作用，尤其對(duì)非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)細(xì)胞有較強(qiáng)的抑制和殺傷作用。目前研究證明PI3K/Akt及MAPK/ERK信號(hào)通路在NSCLC的凋亡、增殖、侵潤(rùn)等一系列生物學(xué)過程中具有重要

3、作用。本研究擬通過將吉非替尼、康萊特注射液以及吉非替尼聯(lián)合康萊特注射液不同干預(yù)處理，作用于T790M基因突變的人肺腺癌NCI-H1975吉非替尼耐藥細(xì)胞株，并檢測(cè)各處理組的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制情況，各處理組在PI3K/Akt及MAPK/ERK信號(hào)通路中Akt和MAPK1(ERK2)基因的表達(dá)情況以及相應(yīng)p-Akt和p-ERK蛋白表達(dá)情況，來(lái)對(duì)康萊特注射液聯(lián)合吉非替尼對(duì)存在T790M突變的人肺腺癌NCI-H1975吉非替尼耐藥細(xì)胞株的作用及其機(jī)制

4、進(jìn)行探索研究。
　　方法:
　　1體外培養(yǎng)人肺腺癌NCI-H1975細(xì)胞，選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)分為空白對(duì)照組，吉非替尼組，康萊特注射液組，吉非替尼聯(lián)合康萊特注射液組;吉非替尼組設(shè)置濃度分別為:0.1μmol/L、0.5μmol/L、1μmol/L、5μmol/L、10μmol/L、25μmol/L、50μmol/L，作用時(shí)間分別為:24h、48h、72h;康萊特注射液組設(shè)置濃度分別為:5μl/ml、10μl/ml

5、、20μl/ml、40μl/ml、80μl/ml、100μl/ml、160μl/ml，作用時(shí)間分別為:24h、48h、72h;應(yīng)用四甲基偶氮唑藍(lán)(tetrzolium-based colorimetric assay，MTT)法分別測(cè)定吉非替尼組和康萊特注射液組的不同濃度、不同作用時(shí)間的抑制率繪制生長(zhǎng)曲線，并分別計(jì)算吉非替尼組30％抑制率所對(duì)應(yīng)濃度(IC30)與康萊特注射液組50％抑制率所對(duì)應(yīng)濃度(IC50)。
　　2確定聯(lián)合用藥

6、組濃度及作用時(shí)間:根據(jù)MTT結(jié)果，吉非替尼組IC30=25μl/ml，康萊特注射液組IC50=40μl/ml，故聯(lián)合用藥組吉非替尼取25μl/ml，康萊特注射液取40μl/ml，作用時(shí)間為48小時(shí)，應(yīng)用MTT法檢測(cè)定各時(shí)間聯(lián)合用藥組的抑制率。
　　3取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，按上述分組進(jìn)行處理。藥物作用48h后提取總RNA，檢測(cè)總RNA的量、純度及濃度，通過逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(reversetranscription PCR，RT-PC

7、R)半定量檢測(cè)各組細(xì)胞內(nèi)Akt基因和MAPK1(ERK2)基因的mRNA的表達(dá)水平。
　　4選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞置入六孔板培養(yǎng)，分組處理同上。藥物作用48h后提取總蛋白，檢測(cè)總蛋白濃度，蛋白質(zhì)印跡(Western-blot)法檢測(cè)各組p-Akt與p-ERK蛋白表達(dá)情況。
　　5運(yùn)用IBM SPSS Statistics22.0.0.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。
　　結(jié)果:
　　1 MTT結(jié)果顯示:
　　1.1與

8、對(duì)照組相比，隨著康萊特注射液組濃度增加及作用時(shí)間的延長(zhǎng)，對(duì)人肺腺癌NCI-H1975細(xì)胞的抑制率逐漸升高，其抑制作用有劑量及時(shí)間依賴效應(yīng);吉非替尼單藥24h組隨藥物濃度的升高，在0.1-5μmol/l范圍內(nèi)未見其對(duì)人肺腺癌NCI-H1975細(xì)胞有明顯抑制情況，在10-50μmol/l范圍內(nèi)出現(xiàn)對(duì)人肺腺癌NCI-H1975細(xì)胞生長(zhǎng)輕度抑制，在吉非替尼單藥48h、72h組對(duì)人肺腺癌NCI-H1975細(xì)胞的抑制率逐漸升高，呈時(shí)間、劑量依賴關(guān)系

9、。
　　1.2聯(lián)合用藥組:吉非替尼聯(lián)合康萊特注射液培養(yǎng)48h后，兩藥聯(lián)合作用抑制率高于各單藥組，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　2 RT-PCR結(jié)果顯示:吉非替尼組、康萊特注射液組以及吉非替尼聯(lián)合康萊特注射液組與對(duì)照組相比，Akt和MAPK1(ERK2)基因的mRNA的表達(dá)水平均有所下調(diào)，其中以聯(lián)合組下調(diào)最為明顯，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);
　　3 Western-blot結(jié)果顯示:吉非替尼組、康萊特注射液組以

10、及吉非替尼聯(lián)合康萊特注射液組與對(duì)照組相比，p-AKT蛋白和p-ERK蛋白的表達(dá)水平均有所下調(diào)，其中以聯(lián)合組下調(diào)最為明顯，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　結(jié)論:
　　1康萊特注射液和吉非替尼單獨(dú)應(yīng)用對(duì)人肺腺癌NCI-H1975細(xì)胞生長(zhǎng)均有抑制作用，而兩藥聯(lián)合抑制作用增強(qiáng)，具有協(xié)同增效作用。
　　2康萊特注射液和吉非替尼單獨(dú)應(yīng)用均能下調(diào)Akt和MAPK1(ERK2)基因以及p-Akt和p-ERK蛋白表達(dá)水平，而兩藥聯(lián)合