X線照射對(duì)NSCLC細(xì)胞系NCI-H1975吉非替尼獲得性耐藥的體外逆轉(zhuǎn).pdf

1、目的:
　　肺癌是人類最常見的惡性腫瘤，其中80％～85％為非小細(xì)胞肺癌(non-small celllung cancer，NSCLC)。治療NSCLC最常用手段是手術(shù)切除輔以放化療。然而，傳統(tǒng)化療藥物多為DNA合成抑制劑，副作用大，特異性差，臨床應(yīng)用受到極大限制。近年來，以吉非替尼（gefitinib）為代表的表皮生長(zhǎng)因子受體酪氨酸激酶抑制劑（epidermal growth factor receptor-tyrosine

2、kinase inhibitors,EGFR-TKIs）在NSCLC臨床治療中療效顯著。研究表明，對(duì)TKI敏感的NSCLC多為腺癌，主要發(fā)生于亞裔、女性、非吸煙患者，且腫瘤細(xì)胞多攜帶EGFR的18、19或21外顯子突變。然而，隨著該類藥物的臨床應(yīng)用時(shí)間推移，人們發(fā)現(xiàn)許多原本對(duì)TKI治療敏感的NSCLC患者在接受治療一段時(shí)間后會(huì)產(chǎn)生獲得性耐藥。克服TKI獲得性耐藥已成為臨床亟待解決的問題。文獻(xiàn)報(bào)道的NSCLC患者TKI獲得性耐藥發(fā)生機(jī)制主

3、要有:EGFR20外顯子的T790M突變，KRAS等EGFR通路下游編碼基因突變，EGFR旁路的其他基因如MET異常擴(kuò)增及癌細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymaltransition，EMT)等。這些耐藥機(jī)制多涉及DNA改變，例如EGFR的T790M突變已被認(rèn)為是TKI獲得性耐藥發(fā)生的較明確的原因。放射線治療腫瘤的機(jī)制是通過損傷細(xì)胞DNA抑制和殺死腫瘤細(xì)胞?？煞裢ㄟ^改變腫瘤細(xì)胞DNA，逆轉(zhuǎn)TKI耐藥值得探討。

4、r>　　本實(shí)驗(yàn)選用人NSCLC細(xì)胞系NCI-H1975（攜帶EGFR21外顯子L858R突變和20外顯子T790M突變）作為親本株，用X線照射自建的吉非替尼獲得性耐藥細(xì)胞系NCI-H1975/GR，建成X線放射細(xì)胞系NCI-H1975/GR/XR。通過比較三株細(xì)胞對(duì)吉非替尼的敏感狀態(tài)，探討X線照射體外逆轉(zhuǎn)NSCLC細(xì)胞系NCI-H1975吉非替尼獲得性耐藥的可能性，并初步探索其機(jī)制，希望為吉非替尼更有效地用于NSCLC個(gè)體化治療提供一些

5、幫助。
　　方法:
　　1.細(xì)胞系的建立
　　1.1 HRMA法明確細(xì)胞系NCI-H1975的EGFR、KRAS和BRAF基因突變狀態(tài);
　　1.2逐步增加藥物濃度、體外間歇作用法誘導(dǎo)NCI-H1975細(xì)胞發(fā)生吉非替尼獲得性耐藥，歷時(shí)1年建成吉非替尼獲得性耐藥細(xì)胞系，命名為NCI-H1975/GR;
　　1.3用X線照射NCI-H1975/GR細(xì)胞，照射劑量6Gy/次，待細(xì)胞恢復(fù)穩(wěn)定生長(zhǎng)，消化傳代后復(fù)用相同

6、劑量的X線照射，共4次，建成X線照射細(xì)胞系，命名為NCI-H1975/GR/XR。
　　2.檢測(cè)三株細(xì)胞生長(zhǎng)及對(duì)吉非替尼的耐藥狀況
　　臺(tái)盼藍(lán)拒染法分別計(jì)數(shù)不同濃度吉非替尼作用后三株細(xì)胞的活細(xì)胞數(shù)，描繪吉非替尼對(duì)其生長(zhǎng)抑制曲線;MTT法檢測(cè)三株細(xì)胞的吉非替尼IC50值和耐藥指數(shù);倒置顯微鏡下直接觀察三株細(xì)胞的形態(tài)及生長(zhǎng)狀況;細(xì)胞計(jì)數(shù)法描繪三株細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線并計(jì)算群體倍增時(shí)間;流式細(xì)胞儀分別檢測(cè)三株細(xì)胞吉非替尼加藥前后的細(xì)胞周

7、期分布變化及凋亡細(xì)胞比例變化。
　　3.Western-Blot法檢測(cè)三株細(xì)胞中E-cadherin和vimentin蛋白的表達(dá)，了解EMT變化狀態(tài)。
　　4.HRM.法檢測(cè)NCI-H1975/GR/XR和NCI-H1975/GR細(xì)胞的EGFR、KRAS和BRAF基因突變狀態(tài)。
　　結(jié)果:
　　1.HRMA法檢測(cè)結(jié)果顯示:NCI-H1975細(xì)胞存在EGFR21外顯子L858R突變和20外顯子T790M突變。

8、>　　2.三株細(xì)胞生長(zhǎng)及對(duì)吉非替尼的耐藥狀況
　　2.1臺(tái)盼藍(lán)拒染法結(jié)果顯示:吉非替尼作用24h后，NCI-1975/GR/XR的活細(xì)胞數(shù)目與NCI-H1975/GR相比無顯著差別(P＞0.05)，但第二天開始， NCI-H1975/GR/XR的活細(xì)胞數(shù)顯著降低(P＜0.05)。在同一作用時(shí)間內(nèi)，NCI-H1975/GR/XR的活細(xì)胞數(shù)與吉非替尼作用濃度呈劑量依賴負(fù)相關(guān);
　　2.2 MTT法檢測(cè)三株細(xì)胞NCI-H1975/

9、GR/XR、NCI-H1975/GR和NCI-H1975的IC50值分別為6.40±0.17μmol/L，12.42±0.09μmol/L和6.15±0.22μmol/L;NCI-H1975/GR對(duì)吉非替尼的耐藥指數(shù)是2.02，而X線照射后細(xì)胞對(duì)吉非替尼的耐藥指數(shù)降低為1.04;
　　2.3三株細(xì)胞在形態(tài)上存在差異，耐藥細(xì)胞NCI-H1975/GR由親本細(xì)胞NCI-H1975的長(zhǎng)梭形變?yōu)榧忓N形，且體積變小;X線照射后NCI-H19

10、75/GR/XR部分細(xì)胞變回長(zhǎng)梭形;
　　2.4 NCI-H1975/GR/XR、NCI-H1975/GR和NCI-H1975群體倍增時(shí)間分別為46.68±2.68h、47.73±3.50h和38.70±5.92h; NCI-H1975/GR/XR倍增時(shí)間較NCI-H1975/GR縮短了1.05h(P＞0.05);
　　2.5與作用前比較，吉非替尼作用后三株細(xì)胞的G0/G1期細(xì)胞比例均有增加(P＜0.05);與NCI-H19

11、75/GR相比，NCI-H1975/GR/XR的G0/G1期細(xì)胞比例增加幅度更為明顯(P＜0.05);
　　2.6與NCI-H1975/GR相比，20、40μmol/L低濃度吉非替尼作用后，NCI-H1975/GR/XR的凋亡細(xì)胞所占比例無顯著差別(P＞0.05);但80μmol/L高濃度吉非替尼作用后，NCI-H1975/GR/XR的凋亡細(xì)胞所占比例明顯升高(P＜0.05)。
　　3.Western-blot結(jié)果顯示:與N

12、CI-H1975相比，NCI-H1975/GR細(xì)胞的E-cadherin蛋白表達(dá)減弱，vimentin蛋白表達(dá)增強(qiáng);與NCI-H1975/GR相比，NCI-H1975/GR/XR細(xì)胞的E-cadherin蛋白表達(dá)增強(qiáng)，vimentin蛋白表達(dá)減弱。
　　4.HRMA法結(jié)果顯示:與NCI-H1975相比，NCI-H1975/GR/XR與NCI-H1975/GR細(xì)胞均未發(fā)現(xiàn)新的突變。
　　結(jié)論:
　　1.X線照射可以體外逆