HMGB1調(diào)控的自噬致非小細(xì)胞肺癌吉非替尼獲得性耐藥機(jī)制和后續(xù)治療策略研究.pdf

1、目的：
　　明確自噬與非小細(xì)胞肺癌吉非替尼獲得性耐藥的相關(guān)性，同時(shí)闡明調(diào)控靶點(diǎn)HMGB1在自噬介導(dǎo)的吉非替尼NSCLC獲得性耐藥中的關(guān)鍵作用，以及Bcl-2和Beclin-1信號(hào)通路與HMGB1及吉非替尼NSCLC獲得性耐藥的關(guān)系。
　　方法：
　　1.在吉非替尼敏感NSCLC細(xì)胞系PC9（EGFR19外顯子缺失）上，經(jīng)吉非替尼處理不同時(shí)間，構(gòu)建吉非替尼獲得性耐藥細(xì)胞株P(guān)C9-R（EGFR T790M、Met擴(kuò)增均為陰

2、性）。通過(guò)AO染色檢測(cè)酸性囊泡、Western blot檢測(cè)耐藥過(guò)程不同階段自噬標(biāo)志蛋白LC3Ⅰ/Ⅱ、p62(SQSTM)表達(dá)，明確在吉非替尼獲得性耐藥與自噬的相關(guān)性。
　　2.采用小分子RNA干擾技術(shù)/脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)，構(gòu)建沉默/過(guò)表達(dá)HMGB1的PC9細(xì)胞，以不同濃度吉非替尼處理后，MTT法檢測(cè)考察抗腫瘤活性，Western blot檢測(cè)自噬標(biāo)志蛋白LC3Ⅰ/Ⅱ、p62表達(dá)，免疫組化法檢測(cè)LC3Ⅰ/Ⅱ的分布，明確HMGB1對(duì)自噬

3、調(diào)控及吉非替尼獲得性耐藥的影響。
　　3.針對(duì)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路HMGB1/B eclin和MAPK/Bcl2/HMGB1，以Western blot為檢測(cè)吉非替尼獲得性耐藥中Beclin-1、Bcl2、pJNK、pERK和p38表達(dá)的變化，考察自噬誘導(dǎo)的吉非替尼獲得性耐藥中HMGB1與Beclin-1和Bcl2的相互作用和結(jié)合情況。
　　結(jié)果：
　　1.吉非替尼耐藥過(guò)程中，自噬標(biāo)志蛋白LC3發(fā)生Ⅰ型向Ⅱ型的轉(zhuǎn)化、p62表達(dá)

4、下降，表明吉非替尼獲得性耐藥過(guò)程中出現(xiàn)自噬。采用自噬抑制劑氯喹以及RNA干擾阻斷技術(shù)調(diào)控自噬水平，通過(guò)MTT法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)抑制自噬的發(fā)生可以明顯增加吉非替尼的抗腫瘤活性，證明自噬介導(dǎo)吉非替尼獲得性耐藥的發(fā)生。
　　2.在構(gòu)建的吉非替尼獲得性耐藥細(xì)胞株P(guān)C9/R中，耐藥過(guò)程中HMGB1的表達(dá)明顯上調(diào);沉默HMGB1的表達(dá)，吉非替尼的抗腫瘤活性明顯增強(qiáng)，表明HMGB1參與吉非替尼獲得性耐藥的發(fā)生。另外，在沉默HMGB1表達(dá)后自噬標(biāo)志蛋白L

5、C3Ⅰ型向Ⅱ型轉(zhuǎn)變減少、p62的下調(diào)被逆轉(zhuǎn)，證明HMGB1通過(guò)介導(dǎo)自噬過(guò)程發(fā)揮調(diào)控吉非替尼獲得性耐藥。
　　3.吉非替尼獲得性耐藥中Beclin-1以及pBcl2表達(dá)上調(diào)，Bcl2表達(dá)減少;抑制Beclin-1能明顯增強(qiáng)吉非替尼的抗腫瘤效果，說(shuō)明Beclin-1參與吉非替尼獲得性耐藥的發(fā)生。在自噬誘導(dǎo)的吉非替尼獲得性耐藥中HMGB1與Beclin-1的結(jié)合明顯增多，促進(jìn)自噬介導(dǎo)的吉非替尼獲得性耐藥的發(fā)生。
　　結(jié)論：