Rab25在非小細胞肺癌厄洛替尼獲得性耐藥中的作用及機制研究.pdf

1、近年來肺癌的發(fā)病率在全球范圍內呈持續(xù)上升趨勢，而這一趨勢在中國尤其明顯。據(jù)報道，肺癌在我國已經成為發(fā)病率和病死率最高的惡性腫瘤，對人群健康構成了嚴重的威脅。而在肺癌病例中，非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)占據(jù)了絕大部分。不幸的是，將近80％的NSCLC病人被診斷時已經處于晚期。他們不像早期病人能通過手術等治療獲得較高的生存率，臨床上對這些病人的治療手段也是很有限的。厄洛替尼（erloti

2、nib）作為表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)酪氨酸酶抑制劑(Tyrosine Kinase Inhibitor, TKI)給晚期NSCLC病人，特別是對EGFR敏感突變的病人帶來了巨大的希望。但是，幾乎所有的病人在用藥半年到一年時會產生厄洛替尼耐藥。盡管現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)多種因素參與了耐藥的發(fā)生，但仍有30％左右的病人耐藥的原因尚不清楚。因此，對NSCLC發(fā)生EGFR-TKI獲得性耐藥

3、機制的進一步探索是當前本領域研究的熱點之一。
　　Rab25是一種分布在上皮細胞的小GTP酶，其異常表達與包括肺癌等多種惡性腫瘤的發(fā)生相關。有文獻報道利用基因芯片的方法研究發(fā)現(xiàn)Rab25可能與厄洛替尼等3種TKI耐藥都相關，但其在NSCLC厄洛替尼獲得性耐藥中的作用和機制有待實驗進一步證實。
　　經典的Wnt/β-catenin信號通路參與調控多種腫瘤的增殖分化及轉移等生物學行為。研究表明，在肺腺癌NCI-H1650細胞中，

4、EGFR的突變特別是T790M突變能磷酸化并激活β-catenin，從而介導核內反式激活，進而導致細胞對厄洛替尼的敏感性下降。而敲低β-catenin的表達能夠明顯改善非敏感的肺腺癌H1975細胞對不可逆性TKI(BIBW2992)的敏感性。這些證據(jù)都表明，β-catenin在TKI原發(fā)和繼發(fā)性耐藥中可能發(fā)揮了一定的作用。而β-catenin在PC9/ER細胞中是否也是Rab25介導的厄洛替尼敏感性的下游機制引起了我們的研究興趣。

5、>　　目的：
　　研究Rab25在厄洛替尼耐藥細胞(PC9/ER)與親本細胞中的表達差異;通過基因敲低手段明確其在NSCLC發(fā)生厄洛替尼獲得性耐藥中的作用，以期為豐富對厄洛替尼耐藥的認識提供新思路、新理念。
　　方法：
　　1.在課題組前期誘導獲得的耐藥細胞PC9/ER基礎上，傳代培養(yǎng)并比較其與親本細胞PC9在形態(tài)上的差異;利用CCK-8法鑒定PC9/ER細胞的耐藥性，并計算耐藥指數(shù)。
　　2.利用qPCR和We

6、stern-Blot比較Rab25在PC9/ER及PC9細胞間基因和蛋白表達水平的差異;利用梯度厄洛替尼濃度刺激兩株細胞，比較兩者Rab25蛋白水平變化及劑量依賴效應;利用免疫熒光法定位Rab25蛋白在兩者細胞定位的不同。
　　3.利用siRNA和慢病毒(LV)轉染技術，敲低Rab25在PC9/ER細胞中的表達，研究Rab25敲減對改善厄洛替尼耐藥的作用;運用流式細胞儀檢測敲減組與對照組的細胞周期變化，明確Rab25敲低對細胞增殖

7、特性的作用。
　　4.在PC9/ER細胞敲低Rab25表達的基礎上，用Western-Blot探索Wnt信號通路蛋白的改變狀態(tài)，并運用激動劑LiCl對信號通路恢復活性以檢測PC9/ER細胞對厄洛替尼敏感性的變化。
　　結果：
　　1.傳代培養(yǎng)的PC9/ER及PC9細胞，在低倍鏡下觀察到:PC9細胞呈長梭形，而PC9/ER細胞呈類圓形;高倍鏡下觀察到:PC9細胞呈散在分布，PC9/ER細胞呈連續(xù)片狀分布。CCK-8實驗表

8、明，PC9/ER細胞的IC50值遠高于PC9細胞[（7.85±1.53）μMvs(0.12±0.04)μM，P＜0.01）]，PC9/ER細胞的耐藥指數(shù)為68.21±21.42，提示耐藥細胞PC9/ER可用于后續(xù)實驗。
　　2.同等厄洛替尼濃度刺激條件下，Rab25的基因和蛋白表達在PC9/ER細胞均高于PC9細胞(P＜0.05);增高的Rab25蛋白主要表達于細胞膜;在PC9及PC9/ER細胞中，Rab25的蛋白水平在0-1μM

9、厄洛替尼之間隨刺激濃度的遞增而增高。
　　3.成功篩選siRab25序列并轉染PC9/ER細胞并敲低Rab25的表達，敲低組的IC50明顯低于對照組[（0.59±0.33）vs（6.14±0.92）μM，P＜0.05];敲低組的增殖指數(shù)明顯低于對照組[(0.53±0.10)vs(0.89±0.06)，P＜0.05]。
　　4.厄洛替尼作用于PC9/ER細胞后，β-catenin蛋白水平明顯高于PC9細胞(P＜0.05);免疫

10、熒光實驗發(fā)現(xiàn)β-catenin主要表達于細胞核;β-catenin和p-GSK-3β蛋白水平在LV-Rab25組低于LV-control組;而LiCl(10mM)能在細胞漿和細胞核中升高LV-Rab25組細胞的β-catenin表達。
　　結論：
　　1.Rab25在PC9/ER細胞中高表達，對其厄洛替尼耐藥具有促進作用。
　　2.Wnt信號通路的激活，導致β-catenin的核表達增加，在Rab25介導的PC9細胞厄