Oct4在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)及對吉非替尼耐藥性的影響.pdf

1、背景：
　　肺癌是我國發(fā)病率最高的惡性腫瘤，占惡性腫瘤死亡原因的第一位。目前，我國每年新發(fā)肺癌約50萬，到2025年預(yù)計(jì)每年將有100萬新發(fā)肺癌患者，近30年來，我國肺癌死亡率上升了465％，嚴(yán)重威脅著人民群眾的健康和生命。非小細(xì)胞肺癌(non-smallcell lung cancer, NSCLC)是肺癌的主要病理類型，約占肺癌的85％～90％。與小細(xì)胞肺癌相比，NSCLC的生長較為緩慢，轉(zhuǎn)移較晚，但診斷時(shí)可手術(shù)切除的病例僅占

2、15～18％，術(shù)后發(fā)生轉(zhuǎn)移或復(fù)發(fā)的機(jī)率很高，以順鉑為基礎(chǔ)的雙藥聯(lián)合化療的緩解率僅30％左右，化療在改善晚期NSCLC患者的生存期方面的作用十分有限。因此整體而言，NSCLC病人的預(yù)后不佳。隨著對肺癌分子分型的研究進(jìn)展，NSCLC的治療已邁入精準(zhǔn)醫(yī)療時(shí)代，表皮生長因子受體（epithelial growth factor receptor，EGFR）是其中研究最廣泛并已廣泛應(yīng)用到臨床的靶向基因之一。在NSCLC患者中，EGFR突變主要發(fā)生

3、在胞內(nèi)段編碼結(jié)構(gòu)域（外顯子18-21），包括外顯子19的缺失突變(delE746-A750)和外顯子21的點(diǎn)突變(L858R)，這些突變使NSCLC對表皮生長因子受體-酪氨酸激酶抑制劑(epithelial growth factor receptor-tyrosine kinase inhibitor，EGFR-TKI)的敏感性增加，稱作增敏EGFR突變，占所有EGFR突變的90％以上，高達(dá)50％的亞洲NSCLC患者中發(fā)現(xiàn)這些增敏EG

4、FR突變。EGFR-TKI使晚期NSCLC的治療從標(biāo)準(zhǔn)含鉑雙藥的化療時(shí)代進(jìn)入靶向治療時(shí)代，以吉非替尼和厄洛替尼為代表的第一代EGFR-TKI已成為EGFR敏感突變陽性患者的一線首選治療藥物。多個(gè)大規(guī)模的臨床試驗(yàn)已證明EGFR敏感突變陽性患者可從EGFR-TKI一線治療中獲益，然而耐藥問題始終如影隨形，多數(shù)存在增敏EGFR突變的NSCLC患者在約8～16個(gè)月治療后對吉非替尼產(chǎn)生耐藥性，對于EGFR-TKI耐藥機(jī)制的探索已成為國內(nèi)外研究的熱

5、點(diǎn)。NSCLC對EGFR-TKI的分子耐藥機(jī)制包括EGFR20外顯子T790M突變、MET基因擴(kuò)增、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)、向小細(xì)胞肺癌轉(zhuǎn)化和EGFR通路的旁路激活等，其中以20外顯子T790M突變最為常見。
　　肺癌耐藥的另一種機(jī)制是獲得腫瘤干細(xì)胞(cancer stem cell，CSC)表型，通過多能性轉(zhuǎn)錄因子（如Oct4，Sox2和Nanog）的表達(dá)介導(dǎo)。

6、CSC，又稱腫瘤干細(xì)胞、癌干細(xì)胞，是指具有干細(xì)胞特性的小部分癌細(xì)胞，即具有“自我復(fù)制”以及“多向分化”能力的癌細(xì)胞。CSC被認(rèn)為是腫瘤克隆的發(fā)生核心，代表驅(qū)動(dòng)腫瘤生長和進(jìn)展的細(xì)胞群體，它是腫瘤發(fā)生、發(fā)展、侵襲轉(zhuǎn)移和耐藥復(fù)發(fā)的根源。多項(xiàng)研究表明肺癌中具有高致瘤性、多潛能、可自我更新、高耐藥的CSC的存在。八聚體結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子4(octamer-binding transcription factor4，Oct4)是胚胎干細(xì)胞維持自我更新及分

7、化潛能的最重要的轉(zhuǎn)錄因子，也是胚胎干細(xì)胞的標(biāo)志物。Oct4在人體多種實(shí)體腫瘤中呈過表達(dá)，并參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。Oct4高表達(dá)患者的疾病進(jìn)展快、易轉(zhuǎn)移并預(yù)后差。使用人非小細(xì)胞肺腺癌細(xì)胞系和患者的原發(fā)性肺癌細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，盡管CSC有不同的表型，但其均表達(dá)多潛能干細(xì)胞基因，尤其是Oct4，Sox2和Nanog，可以作為CSC的標(biāo)志物。Oct4與腫瘤干細(xì)胞的多藥耐藥(multidrug resistance，MDR)表型相關(guān)，在惡性腫

8、瘤化療耐藥的發(fā)生和發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用，這使Oct4可能成為癌癥治療的重要靶標(biāo)，特別是針對具有化療抗性的腫瘤類型，然而，很少有研究涉及Oct4在腫瘤靶向藥物的耐藥過程中所起的作用。有研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因CCSP-rtTA/TetO-EGFR(L858R/T790M)誘導(dǎo)EGFR突變吉非替尼耐藥的小鼠肺組織中Oct4和Sox2表達(dá)增加。然而，調(diào)節(jié)CSC在吉非替尼耐藥性中的分子機(jī)制尚未完全澄清。信號傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活子3(signal trans

9、ducer and ac-tivatorof transcription3，STAT3)是高度保守的轉(zhuǎn)錄因子家族成員之一，正常情況下參與細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡的調(diào)控，在惡性腫瘤中也與腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移、腫瘤血管的發(fā)生及腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸等有關(guān)，并通過調(diào)節(jié)干細(xì)胞相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)參與維持干細(xì)胞表型和多能性。Survivin是凋亡抑制蛋白家族中的重要成員，survivin基因啟動(dòng)子上含有STAT3的結(jié)合位點(diǎn)。STAT3途徑也參與肺癌的發(fā)生，STAT

10、3的激活是NSCLC對EGFR-TKI耐藥的內(nèi)在機(jī)制，Oct4是否在STAT3/survivin信號途徑中發(fā)揮作用尚少研究。對Oct4在NSCLC中的表達(dá)及其對吉非替尼耐藥性影響的相關(guān)機(jī)制進(jìn)行研究能夠更好的闡明肺癌耐藥的發(fā)生和發(fā)展機(jī)制，從而采取針對性的治療策略以期進(jìn)一步提高EGFR突變肺癌患者的靶向藥物治療的有效率和持久性。
　　目的：
　　探討Oct4 mRNA和蛋白在NSCLC患者腫瘤組織的表達(dá)及其與患者臨床病理特征的相

11、關(guān)性，應(yīng)用Oct4-siRNA轉(zhuǎn)染構(gòu)建特異性沉默Oct4基因表達(dá)的PC-9和PC-9/GR細(xì)胞系，探討Oct4在NSCLC中對腫瘤細(xì)胞增殖和吉非替尼獲得性耐藥的作用及其可能的信號通路。
　　方法：
　　(1)Oct4在非小細(xì)胞肺癌組織中的表達(dá)及意義
　　86例NSCLC患者肺癌組織樣本（NSCLC組）及其相應(yīng)癌旁正常組織樣本（對照組）。采用熒光定量PCR法、免疫組化法以及western blot法分別檢測上述組織樣本中

12、Oct4 mRNA和蛋白的表達(dá)，分析其表達(dá)與患者臨床病理特征包括年齡、性別、吸煙指數(shù)、腫塊大小、分化程度、TNM分期及病理類型等的相關(guān)性。
　　(2)Oct4在非小細(xì)胞肺癌增殖及對吉非替尼耐藥中的作用
　　選擇含有EGFR外顯子19缺失突變的人肺癌細(xì)胞系PC-9及吉非替尼獲得性耐藥的細(xì)胞系PC-9/GR作為研究對象，采用熒光定量PCR法和westernblot法分別檢測PC-9細(xì)胞和PC-9/GR細(xì)胞中Oct4 mRNA和蛋

13、白的表達(dá)。應(yīng)用Oct4-siRNA轉(zhuǎn)染構(gòu)建特異性沉默Oct4基因表達(dá)的PC-9和PC-9/GR細(xì)胞系，分為四組:Con-siRNA PC-9細(xì)胞組（轉(zhuǎn)染Con-siRNA）、Oct4-siRNA PC-9細(xì)胞組（轉(zhuǎn)染Oct4-siRNA）、Con-siRNA PC-9/GR細(xì)胞組（轉(zhuǎn)染Con-siRNA）和Oct4-siRNA PC-9/GR細(xì)胞組（轉(zhuǎn)染Oct4-siRNA）。Western blot法檢測抑制Oct4基因表達(dá)后人肺癌P

14、C-9細(xì)胞和PC-9/GR細(xì)胞中Oct4蛋白的表達(dá)情況，MTT法檢測PC-9細(xì)胞和PC-9/GR細(xì)胞在轉(zhuǎn)染后24h、48h和72h時(shí)的增殖活性。然后將PC-9和PC-9/GR細(xì)胞各分為4組-Con-siRNA組（轉(zhuǎn)染Con-siRNA）、Con-siRNA+Gefitnib組（2.5μM吉非替尼+轉(zhuǎn)染Con-siRNA）、Oct4-siRNA組(轉(zhuǎn)染Oct4-siRNA)和Oct4-siRNA+Gefitnib組(2.5μM吉非替尼+轉(zhuǎn)

15、染Oct4-siRNA)，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測上述各組細(xì)胞的凋亡率。
　　(3)OCT4對非小細(xì)胞肺癌吉非替尼耐藥的機(jī)制研究
　　Western blot法檢測PC-9細(xì)胞和PC-9/GR細(xì)胞中p-STAT3和survivin蛋白的表達(dá)，免疫熒光檢測Oct4和p-STAT3蛋白在PC-9細(xì)胞和PC-9/GR細(xì)胞的表達(dá)。應(yīng)用Oct4-siRNA轉(zhuǎn)染構(gòu)建特異性沉默Oct4基因表達(dá)的PC-9和PC-9/GR細(xì)胞系，分為四組:Con-

16、siRNA PC-9細(xì)胞組（轉(zhuǎn)染Con-siRNA）、Oct4-siRNA PC-9細(xì)胞組（轉(zhuǎn)染Oct4-siRNA）、Con-siRNA PC-9/GR細(xì)胞組(轉(zhuǎn)染Con-siRNA)和Oct4-siRNA PC-9/GR細(xì)胞組（轉(zhuǎn)染Oct4-siRNA），采用熒光定量PCR法及western blot法分別檢測上述四組Oct4，p-STAT3和survivinmRNA和蛋白的表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　(1)Oct4在非小細(xì)

17、胞肺癌組織中的表達(dá)及意義
　　熒光定量PCR檢測結(jié)果表明，NSCLC組中Oct4 mRNA的表達(dá)量明顯高于對照組(t=3.566，P=0.008)。Western blot法檢測結(jié)果表明，NSCLC組中Oct4蛋白的表達(dá)量明顯高于對照組（t=3.764，P=0.007）。免疫組化檢測結(jié)果表明，Oct4蛋白染色陽性呈棕黃色顆粒狀;與對照組相比，NSCLC組Oct4蛋白的陽性細(xì)胞百分比明顯增高(t=8.033，P＜0.001)。Oct

18、4的表達(dá)在患者的性別、年齡、吸煙指數(shù)和腫塊大小等方面無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），而與患者的病理類型，分化程度和TNM分期有關(guān)，在腺癌、分化程度低和TNMⅢ期的患者中Oct4表達(dá)明顯增加(P＜0.05)。
　　(2)Oct4在非小細(xì)胞肺癌增殖及對吉非替尼耐藥中的作用
　　與PC-9細(xì)胞相比，PC-9/GR細(xì)胞中Oct4 mRNA（t=4.21，P=0.006）和Oct4蛋白（t=4.233，P=0.005）的表達(dá)量均明顯增高

19、。在PC-9細(xì)胞中，Oct4-siRNA組Oct4蛋白的表達(dá)量明顯低于Con-siRNA組(t=3.985，P=0.009)。在PC-9/GR細(xì)胞中，Oct4-siRNA組Oct4蛋白的表達(dá)量明顯低于Con-siRNA組（t=4.117，P=0.007）。在PC-9和PC-9/GR細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染后24h、48h和72h時(shí)Oct4-siRNA組增殖活性均明顯低于Con-siRNA組（P＜0.05）。在PC-9細(xì)胞中，與Con-siRNA組相

20、比，Con-siRNA+Gefitnib組的細(xì)胞凋亡率明顯增高(X2=8.644，P=0.003);與Oct4-siRNA組相比，Oct4-siRNA+Gefitnib組的細(xì)胞凋亡率明顯增高(X2=9.019，P=0.002)。在PC-9/GR細(xì)胞中，與Con-siRNA組相比，Con-siRNA+Gefitnib組的細(xì)胞凋亡率無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(X2=1.413，P=0.872);與Oct4-siRNA組相比，Oct4-siRNA+Gefi

21、tnib組的細(xì)胞凋亡率明顯增高(X2=8.798，P=0.004)。
　　(3)OCT4對非小細(xì)胞肺癌吉非替尼耐藥的機(jī)制研究
　　與PC-9細(xì)胞相比，PC-9/GR細(xì)胞中磷酸化STAT3（p-STAT3）蛋白的表達(dá)量明顯增高(t=4.197，P=0.004);與PC-9細(xì)胞相比，PC-9/GR細(xì)胞中survivin蛋白的表達(dá)量明顯增高(t=3.639，P=0.008)。免疫熒光檢測結(jié)果表明，Oct4與p-STAT3蛋白在PC

22、-9細(xì)胞和PC-9/GR細(xì)胞均表達(dá)于細(xì)胞核，而兩者在PC-9/GR細(xì)胞中的表達(dá)水平較PC-9細(xì)胞明顯提高。熒光定量PCR檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在PC-9細(xì)胞， Oct4-siRNA組Oct4、p-STAT3和survivin mRNA的表達(dá)量與Con-siRNA組相比均明顯減少(t=2.934，3.024，3.216，P=0.037，0.031，0.025);在PC-9/GR細(xì)胞，Oct4-siRNA組Oct4、p-STAT3和survivin

23、mRNA的表達(dá)量與Con-siRNA組相比均明顯減少(t=3.108，2.014，2.572，P=0.009，0.028，0.017)。Western blot法檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在PC-9細(xì)胞，Oct4-siRNA組Oct4、p-STAT3和survivin蛋白的表達(dá)量與Con-siRNA組相比均明顯減少(t=2.889，2.985，2.917，P=0.018，0.007，0.013);在PC-9/GR細(xì)胞，Oct4-siRNA組Oct4

24、、p-STAT3和survivin蛋白的表達(dá)量與Con-siRNA組相比均明顯減少（t=3.737，3.756，3.011， P=0.002，0.002，0.007）。
　　結(jié)論：
　　(1)Oct4在NSCLC組織中的表達(dá)增加;Oct4高表達(dá)與NSCLC的低分化、TNM分期高及病理分型有關(guān)，Oct4高表達(dá)可作為NSCLC預(yù)后差的一個(gè)判斷指標(biāo)。
　　(2)Oct4與NSCLC細(xì)胞對吉非替尼的耐藥性有關(guān)。特異性沉默Oct

25、4基因表達(dá)能夠逆轉(zhuǎn)NSCLC細(xì)胞對吉非替尼的的耐藥性并促進(jìn)細(xì)胞凋亡。
　　(3)p-STAT3/survivin信號通路可能與NSCLC細(xì)胞對吉非替尼的的獲得性耐藥有關(guān)。Oct4的下調(diào)可以逆轉(zhuǎn)NSCLC細(xì)胞對吉非替尼的的獲得性耐藥，其機(jī)制可能與p-STAT3/survivin信號通路有關(guān)。
　　創(chuàng)新性及意義：
　　本研究發(fā)現(xiàn)Oct4在維持肺腺癌細(xì)胞PC-9/GR對吉非替尼的耐藥性方面具有重要作用，選擇性抑制Oct4表達(dá)