DHA增強吉非替尼對EGFR基因突變的非小細胞肺癌的抗瘤作用.pdf

1、肺癌是當前世界范圍內(nèi)發(fā)病率最高的惡性腫瘤，近50年來肺癌的發(fā)病率在持續(xù)顯著增加，而且肺癌死亡率已經(jīng)高居我國惡性腫瘤死亡率排行的榜首。肺癌成為危害生命健康的一種主要疾病。非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)是肺癌的主要病理類型之一，占肺癌的80％，也是我國肺癌的主要病理類型。肺癌在起病早中期多無特異的臨床癥狀，大部分的肺癌在發(fā)現(xiàn)時已經(jīng)喪失了手術(shù)治療的機會，而且雖然手術(shù)、化療、放療技術(shù)在不斷提高，

2、但非小細胞肺癌患者的預(yù)后仍然很差，這也是肺癌高死亡率的重要原因。伴隨著分子遺傳學(xué)研究的不斷進展，針對癌基因突變的分子靶向治療已經(jīng)成為進展期非小細胞肺癌治療的重要手段。吉非替尼作為代表性的表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑(EGFR-TKI)，是肺癌分子靶向治療藥物中的突出代表。吉非替尼與表皮生長因子受體(EGFR)的腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)激酶結(jié)合位點上的三磷酸腺苷競爭，阻斷其酪氨酸激酶活性，影響EGFR的信號傳導(dǎo)通路，從而影響肺癌細胞

3、的生長。相較于傳統(tǒng)意義上的放化療，吉非替尼對于表皮生長因子受體突變的非小細胞肺癌有著更好的療效和安全性。在2003年吉非替尼通過了美國食品藥品管理局(FDA)認證用于治療EGFR突變的非小細胞肺癌。2011年中國版非小細胞肺癌實踐指南將吉非替尼列為了EGFR突變的非小細胞肺癌的一線治療藥物。
　　多不飽和脂肪酸(PUFA)指含有兩個或兩個以上雙鍵且碳鏈長度為18～22個碳原子的直鏈脂肪酸。根據(jù)多不飽和脂肪酸中第一個不飽和鍵出現(xiàn)在碳

4、鏈甲基端的位置，通常分為N-3多不飽和脂肪酸（第一個不飽和鍵出現(xiàn)在碳鏈甲基端的第三位）和N-6多不飽和脂肪酸（第一個不飽和鍵出現(xiàn)在碳鏈甲基端的第六位）。DHA(docosahexaenoic acid，DHA)，二十二碳六烯酸，屬于N-3多不飽和脂肪酸家族中的重要成員。近年來研究顯示DHA對人類健康有很大益處，DHA可以預(yù)防和治療很多慢性疾病，包括心血管疾病、炎癥反應(yīng)、神經(jīng)退行性病變等等。流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)在飲食中富含DHA的沿海區(qū)域，腫

5、瘤的發(fā)生發(fā)展水平更低。近期的一些體外及體內(nèi)試驗顯示以DHA為代表的N-3多不飽和脂肪酸有顯著的抗腫瘤作用，細胞學(xué)試驗和動物學(xué)試驗已經(jīng)證實了DHA可以抑制肺癌細胞的增殖。一些研究還發(fā)現(xiàn)N-3多不飽和脂肪酸可以增強一些化療藥物的抗腫瘤活性。
　　DHA對于EGFR基因突變的非小細胞肺癌細胞和無EGFR基因突變的非小細胞肺癌增殖有無差異影響，DHA對于吉非替尼的抗肺癌細胞作用有無影響，若DHA和吉非替尼對肺癌細胞能起到協(xié)同抑制作用，作用

6、的機制可能是什么，這些情況目前尚無報道。本實驗中，我們選取了兩類非小細胞肺癌細胞:EGFR基因突變的PC9細胞和無EGFR基因突變即EGFR基因野生型的A549細胞。試驗通過一系列梯度濃度和作用時間的DHA和吉非替尼比較其對PC9細胞和A549細胞的活力及增殖能力的影響;通過DHA和吉非替尼單獨或聯(lián)合治療比較其對EGFR基因突變和野生型非小細胞肺癌凋亡和細胞周期的影響;通過Western免疫印跡技術(shù)了解磷酸化和非磷酸化EGFR and

7、ERK1/2的水平，了解其對信號通路的影響來揭示部分作用機制。旨在探討DHA可否作為營養(yǎng)干預(yù)手段增強靶向治療藥物吉非替尼對非小細胞肺癌的治療作用。
　　研究目的:
　　我們本次研究的目的旨在探討DHA和吉非替尼對EGFR基因突變的非小細胞肺癌的影響。細胞的活力及增殖能力、細胞凋亡、細胞核形態(tài)、細胞周期以及表皮生長因子受體磷酸化水平均包含于我們的研究內(nèi)容中，以了解兩種藥物之間有無協(xié)同或拮抗作用，及其可能的作用機制。
　　

8、研究材料與方法:
　　本實驗中我們選取了兩類非小細胞肺癌細胞:EGFR突變的PC9細胞系(EGFR基因的19外顯子缺失，E746-A750型)和含有野生型EGFR的A549細胞系。細胞的培育使用的是DMEM/F12培養(yǎng)基，培養(yǎng)24至72小時。待細胞在培養(yǎng)皿中生長達到80％-90％滿時，取出培養(yǎng)皿，使用0.25％胰蛋白酶消化處理后，進行傳代培養(yǎng)（1∶3進行傳代）。
　　分別選擇濃度梯度和時間梯度的DHA和吉非替尼作用于PC9細

9、胞和A549細胞，MTT法分析DHA和/或吉非替尼對兩種細胞活力的影響?？寺⌒纬蓪嶒灧治鯠HA和/或吉非替尼對兩細胞系增殖的影響。流式細胞術(shù)分析DHA和吉非替尼單藥治療、聯(lián)合治療對兩種非小細胞肺癌的凋亡影響，熒光顯微鏡觀察細胞核形態(tài)變化。通過流式細胞分析儀檢測DHA和吉非替尼單藥治療、聯(lián)合治療對兩種非小細胞肺癌細胞周期的影響。通過Western blot檢測了解DHA和吉非替尼單藥治療、聯(lián)合治療對兩種非小細胞肺癌磷酸化和非磷酸化EGFR

10、and ERK1/2水平的影響。試驗步驟均重復(fù)進行三次，將重復(fù)三次的實驗結(jié)果計算平均值±標準差。應(yīng)用GraphPad Prism5.0進行數(shù)據(jù)分析。其中，計量資料應(yīng)用均數(shù)±標準差（x±s）來表示，采用單因素方差分析進行多組數(shù)據(jù)差異比較。P＜0.05和＜0.01均認為具有統(tǒng)計學(xué)差異。
　　研究結(jié)果:
　　1.MTT檢測證實DHA與吉非替尼均以濃度及時間依賴方式抑制突變型的PC9細胞及野生型的A549細胞的活力。根據(jù)細胞生長抑制

11、率的不同，我們使用100μg/ml的DHA溶液聯(lián)合60nmol/L的吉非替尼溶液處理PC9細胞，同時使用100μg/ml的DHA溶液聯(lián)合15μmol/L的吉非替尼溶液處理A549細胞。DHA和吉非替尼聯(lián)合用藥對細胞活力抑制起協(xié)同作用，即DHA增加吉非替尼對PC9細胞及A549細胞的活力抑制。
　　2.克隆形成實驗顯示DHA和吉非替尼均以濃度和時間依賴方式抑制EGFR基因突變的PC9細胞和EGFR基因野生型的A549細胞增殖。經(jīng)過o

12、ne-way ANOVA分析及Newman-Keuls多重比較檢驗后我們發(fā)現(xiàn)，無論是兩個單一用藥組，還是聯(lián)合用藥組，其對PC9細胞和A549細胞克隆形成的抑制作用與對照組相比均是增強的，且具有統(tǒng)計學(xué)意義，P值＜0.01。同時，將聯(lián)合用藥組的結(jié)果與單獨使用DHA和吉非替尼的實驗組相比較，聯(lián)合用藥組的克隆形成抑制作用也明顯強于單一用藥組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，P值＜0.01。
　　3.對于PC9細胞，與對照組相比，DHA和吉非替尼在單一

13、用藥時和聯(lián)合用藥時對于絀胞凋亡的促進作用都具有統(tǒng)計學(xué)意義，P值均＜0.01;而且DHA與吉非替尼聯(lián)合用藥組與單獨使用DHA或吉非替尼處理的實驗組相比，其對PC9細胞凋亡的促進作用也具有統(tǒng)計學(xué)意義，P值均＜0.01。對于A549細胞，各個實驗組凋亡百分比與對照組相比差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義，P值均＞0.05;聯(lián)合用藥組與兩個單一用藥組相比差異也沒有統(tǒng)計學(xué)意義，P值均＞0.05。DHA和吉非替尼單藥及聯(lián)合治療對A549細胞的凋亡均沒有明顯影響。<

14、br>　　4.通過DAPI染色和熒光顯微鏡觀察細胞核形態(tài)，我們發(fā)現(xiàn)單獨應(yīng)用DHA或吉非替尼或者聯(lián)合用藥對于PC9細胞核都有影響，而DHA聯(lián)合吉非替尼對PC9細胞的細胞核影響最大，包括核形態(tài)的改變，異形核數(shù)量的增多，核密度改變等。這一結(jié)果反映出聯(lián)合用藥對于PC9細胞的凋亡有明顯影響，這與流式細胞儀檢測到的細胞凋亡結(jié)果是一致的。而對于A549細胞，無論是單獨應(yīng)用DHA或吉非替尼，還是聯(lián)合應(yīng)用兩種藥物，細胞核形態(tài)和密度改變都不明顯，這一結(jié)果也

15、進一步印證了流式細胞儀檢測觀察到的A549細胞凋亡情況。
　　5.通過流式細胞儀檢測經(jīng)過藥物處理的突變型PC9細胞和野生型A549細胞，我們發(fā)現(xiàn)DHA和吉非替尼對兩種細胞的細胞周期都存在一定的影響。使用DHA和/或吉非替尼處理PC9細胞，結(jié)果顯示無論是單一用藥還是聯(lián)合用藥都會延長PC9細胞的G0G1期和G2M期，同時會縮短細胞的S期。而聯(lián)合用藥比單藥更加有效得延長PC9細胞的G0G1期。使用DHA和/或吉非替尼處理A549細胞，結(jié)

16、果顯示無論是單獨應(yīng)用DHA或吉非替尼，或者聯(lián)合應(yīng)用兩種藥物都能夠有效延長A549細胞得G0G1期。同時還能夠有效縮短細胞的S期，且聯(lián)合用藥對于S期的縮短效果明顯強于單獨應(yīng)用DHA或吉非替尼。
　　吉非替尼和DHA對PC9及A549細胞周期影響趨勢一致，均增加G0/G1期細胞比例，降低S期細胞比例。相比于單藥治療，聯(lián)合用藥在增加PC9細胞G0/G1期比例和減低A549細胞S期比例方面具備統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　6.免

17、疫印跡分析顯示DHA能夠明顯抑制PC9細胞的ERK1/2的磷酸化，而在A549細胞中，DHA則是促進了EGFR的磷酸化，同時明顯抑制ERK1/2的磷酸化;吉非替尼能夠明顯抑制PC9細胞和A549細胞中EGFR和ERK1/2的磷酸化;當DHA與吉非替尼聯(lián)合使用時，在PC9細胞和A549細胞中都能夠明顯抑制EGFR和ERK1/2的磷酸化，對于PC9細胞ERK1/2磷酸化的抑制效果明顯強于單獨應(yīng)用DHA或吉非替尼處理細胞時，對于A549細胞，