細(xì)胞自噬促進(jìn)拉帕替尼抗HER2陽性乳腺癌的機(jī)制研究.pdf

1、乳腺癌是嚴(yán)重威脅全球女性健康的惡性腫瘤,約占女性腫瘤的四分之一。近年來我國的乳腺癌發(fā)病率和死亡率也都呈明顯上升趨勢,且發(fā)病年齡趨于年輕化。HER2(ErbB2)陽性乳腺癌約占乳腺癌總數(shù)的25％左右,腫瘤進(jìn)展快、易復(fù)發(fā)、易轉(zhuǎn)移且預(yù)后不佳。因此,開發(fā)針對 HER2的分子靶向治療藥物始終是這一領(lǐng)域的研究熱點。曲妥珠單抗(Trastuzumab)作為人源化的抗HER2抗體,在HER2靶向治療中應(yīng)用最為廣泛和成熟。但是,僅有35%左右的HER2陽

2、性乳腺癌患者對Trastuzumab治療有效,并且大多數(shù)的患者在接受 Trastuzumab治療1年左右出現(xiàn)耐藥。因此,亟需開發(fā)新的針對HER2的靶向性藥物。
　　拉帕替尼(Lapatinib)作為新的HER2靶向治療性小分子抑制劑,可以同時競爭結(jié)合EGFR和HER2胞內(nèi)段激酶區(qū)域的AT P結(jié)合位點,從而抑制HER2陽性乳腺癌細(xì)胞的增殖。2010年,FDA批準(zhǔn)Lapatinib與卡培他濱(Capecitabine)合并治療晚期或轉(zhuǎn)

3、移性乳腺癌。Lapatinib可明顯延長患者的生存時間,對復(fù)發(fā)性晚期或轉(zhuǎn)移性乳腺癌具有顯著療效。相對于Trastuzumab,Lapatinib具有可口服、易進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮藥理作用、同時拮抗EGFR和HER2兩種受體的信號通路、易透過血腦屏障治療乳腺癌腦轉(zhuǎn)移等獨特優(yōu)勢。并且Lapatinib對于 Trastuzumab治療失敗的進(jìn)展期患者依然有效,這使得人們對Lapatinib的應(yīng)用前景十分看好。但是,Lapatinib的臨床治療反應(yīng)性

4、僅有24%左右,是否可通過與其它藥物的聯(lián)合應(yīng)用,提高其治療效果呢?
　　研究表明,HER2陽性乳腺癌患者中,HER2基因的過表達(dá)會激活下游信號分子的級聯(lián)鏈鎖反應(yīng);HER2的高表達(dá)可以促使PI3K、Akt、mTOR、p70SK等過度磷酸化,促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖。而Lapatinib主要通過阻斷PI3K、Akt等信號通路抑制HER2陽性乳腺癌細(xì)胞的增殖。已有明確的實驗證據(jù)顯示:PI3K/Akt/mTOR、LKB1/AMPK/mTO R等

5、信號通路是細(xì)胞自噬發(fā)生的主要上游調(diào)控分子。細(xì)胞自噬猶如一柄雙刃劍,可以抑制腫瘤的形成,也可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生存。究竟細(xì)胞自噬在腫瘤細(xì)胞生存過程中是發(fā)揮保護(hù)作用還是發(fā)揮抑制作用,一直存在爭議。那么,細(xì)胞自噬是否參與了Lapatinib的抗腫瘤作用呢?這是本課題需要解決的關(guān)鍵問題之一。
　　非甾體抗炎藥(Nonsteroidal Antiinflammatory Drugs,NSAIDs)和他汀類藥物(HRIS)是一類具有較廣譜抗腫瘤

6、作用的經(jīng)典藥物。《柳葉刀》雜志報道,每天服用少量阿司匹林片(Aspirin)可以有效降低多種腫瘤的發(fā)病率,甚至可以治療腫瘤。洛伐他汀(Lovastatin)亦被證實可使乳腺癌MCF-7細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)發(fā)生一些正向分化的表現(xiàn)。而NSAIDs和HRIS都具備長期用藥經(jīng)驗,且現(xiàn)在對其抗腫瘤機(jī)制的研究也逐漸深入。Aspirin在結(jié)腸癌細(xì)胞中可以抑制mTOR,激活A(yù)MPK通路而抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖和遷移。那么,NSAIDs或HRIS與Lapatin

7、ib是否可以聯(lián)合應(yīng)用以增強(qiáng) Lapatinib對 HER2陽性乳腺癌的治療效果,這一研究將為 HER2陽性乳腺癌患者提供有效的治療方案。因此,本課題將分析Aspirin、水楊酸鈉(Sodium Salicylate)、Lovastatin分別與Lapatinib聯(lián)合應(yīng)用后,對HER2陽性乳腺癌發(fā)生發(fā)展的生物學(xué)特征,并闡明可能的機(jī)制。
　　在本課題中,我們首先利用MTT、平板克隆、EDU等檢測手段研究了Lapatinib對HER2陽

8、性乳腺癌細(xì)胞BT474和AU565的抗增殖能力,并通過細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察、流式細(xì)胞術(shù)、蛋白免疫印跡檢測凋亡蛋白的表達(dá)水平,并確定了其誘導(dǎo)凋亡能力及其對HER2及下游分子的影響。進(jìn)一步,通過透射電鏡、AO染色、GFP-LC3轉(zhuǎn)染、蛋白免疫印跡等技術(shù)證實Lapatinib可以誘導(dǎo)HER2陽性乳腺癌細(xì)胞發(fā)生自噬。隨后我們發(fā)現(xiàn),經(jīng)細(xì)胞自噬抑制劑3-MA預(yù)先處理2 h后,Lapatinib誘導(dǎo)BT474和AU565細(xì)胞的自噬能力被抑制,細(xì)胞增殖能力明

9、顯增強(qiáng),細(xì)胞周期 S期的阻滯亦有緩解。凋亡分子Caspase-3和PARP分解減少,流式細(xì)胞術(shù)顯示凋亡率亦有明顯減少。最后,通過 Western-blot分析發(fā)現(xiàn),3-MA可以解除 Lapatinib對 HER2及其下游通路mTOR/p70SK/Akt的抑制作用。同時,自噬相關(guān)蛋白AMPK的表達(dá)被3-MA下調(diào)。因此,Lapatinib可誘導(dǎo)BT474和AU565細(xì)胞自噬,并有助于其促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡。該結(jié)果對理解細(xì)胞自噬在腫瘤治療中的功能

10、具有重要價值,同時也為 HER2陽性乳腺癌的聯(lián)合用藥提供了新的靶點。
　　本課題中我們首次將Aspirin、Sodium Salicylate等NSAIDs及Lovastatin分別與Lapatinib聯(lián)合應(yīng)用,通過MTT實驗、平板克隆形成,及EDU染色實驗均證實低劑量NSAIDs及Lovastatin與Lapatinib聯(lián)合作用可以協(xié)同Lapatinib對HER2陽性乳腺癌細(xì)胞增殖的抑制作用。AO染色發(fā)現(xiàn)低劑量NSAIDs或Lo

11、vastatin短時間作用時,可以誘導(dǎo)BT474和AU565細(xì)胞的自噬,而高劑量長時間作用則以殺傷作用為主。細(xì)胞自噬可能是聯(lián)合用藥發(fā)揮協(xié)同作用的機(jī)制之一。
　　在本課題中,我們對細(xì)胞自噬在Lapatinib單藥及其與NSAIDs或HRIS聯(lián)合用于抗 HE R2陽性乳腺癌細(xì)胞增殖的機(jī)制研究中只揭開了冰山一角,如果細(xì)胞自噬確實可以作為 HER2腫瘤治療的新靶點,那么聯(lián)合 NSAIDs或 HRIS等經(jīng)典藥物將為HER2陽性乳腺癌的治療提