乳腺癌HER2基因定量檢測(cè)及應(yīng)用.pdf

1、乳腺癌是婦女最常見的惡性腫瘤之一，嚴(yán)重危害婦女的健康。近年來，其發(fā)病率在世界范圍內(nèi)呈上升趨勢(shì)。我國(guó)雖屬乳腺癌發(fā)病率較低國(guó)家，但近年發(fā)病率也在不斷上升。一般認(rèn)為乳腺癌的預(yù)后和疾病分期、療效關(guān)系密切，近年來研究發(fā)現(xiàn)檢測(cè)腫瘤分子標(biāo)記物，對(duì)指導(dǎo)腫瘤治療方案的選擇、復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的監(jiān)測(cè)，療效評(píng)價(jià)、腫瘤組織來源的判定和鑒別診斷、預(yù)后判斷、尋找免疫和生物治療靶點(diǎn)等有重要價(jià)值。
　　 HER2/neu基因(以下簡(jiǎn)稱HER2基因)，其結(jié)構(gòu)與表皮生長(zhǎng)因子

2、受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)有高度的同源性，是EGFR家族成員中的第2號(hào)，定位于染色體17q21上，其編碼的蛋白質(zhì)被稱為HER2，為185kD的跨膜糖蛋白，又稱p185蛋白，具有內(nèi)在酪氨酸激酶活性，參與調(diào)控細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖及分化，是公認(rèn)的重要腫瘤分子標(biāo)志物之一。它在基因水平上反映腫瘤變化過程，包括癌前起始階段，癌的發(fā)生發(fā)展，基因的調(diào)控和信號(hào)傳導(dǎo)等方面。檢測(cè)HER2基因的狀況，在指導(dǎo)化

3、療，判斷預(yù)后，為臨床應(yīng)用具有里程碑式的分子靶向藥物赫賽汀(Herceptin)治療乳腺癌提供依據(jù)等方面具有重要意義。目前，HER2的檢測(cè)方法最常用的有ELISA、FISH及IHC法。ELISA法主要用于檢測(cè)乳腺癌患者血清或新鮮腫瘤組織中的p185總蛋白。此方法敏感、簡(jiǎn)單、安全且費(fèi)用低，適用于新鮮標(biāo)本，但難以反映基因擴(kuò)增狀態(tài)。FISH法用于檢查分裂期細(xì)胞的核型、識(shí)別染色體數(shù)目、確定腫瘤細(xì)胞的來源。此方法特異性高且穩(wěn)定、敏感，能直接觀察HE

4、R2基因的擴(kuò)增量。缺點(diǎn)主要足操作繁瑣，價(jià)格昂貴，難以普及。IHC法因操作簡(jiǎn)便，目前被廣泛應(yīng)用，但假陰性較高，且對(duì)陽(yáng)性信號(hào)程度的判讀上主觀因素影響較大。為此我們建立應(yīng)用實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)(Real-time PCR)檢測(cè)HER2基因表達(dá)的方法，并檢測(cè)208例臨床乳腺癌患者腫瘤組織中的HER2基因的表達(dá)，并與原位雜交免疫熒光(FISH)及免疫組織化學(xué)(IHC)法相比較，探討其優(yōu)缺點(diǎn)。
　　 通過Primer Express5.0軟件，

5、設(shè)計(jì)出5對(duì)HER2引物和線形Taqman探針，通過擴(kuò)增試驗(yàn)比較，成功選出一對(duì)擴(kuò)增效率最高的引物和探針，確定了熒光定量PCR擴(kuò)增體系和循環(huán)參數(shù)。經(jīng)過質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品檢測(cè)建立了標(biāo)準(zhǔn)曲線，取得了較好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)達(dá)0.993。批內(nèi)、批間、日間重復(fù)性好，變異系數(shù)均在5％以下，靈敏度為10拷貝/μl，檢測(cè)特異性為100％。
　　 應(yīng)用Real-time PCR、FISH及IHC同時(shí)檢測(cè)乳腺癌組織中的HER2基因的表達(dá)，208例乳腺癌病例中

6、，按IHC評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，86例(41.3％)++/+++陽(yáng)性，其中51例(24.5％)為+++，35例(16.8％)為++，122例(58.7％)是完全陰性或+，或?yàn)榘麧{反應(yīng)假陽(yáng)性，其中41例(19.7％)是+，81例(38.9％)是完全陰性或?yàn)榘麧{反應(yīng)假陽(yáng)性；雙色原位雜交檢測(cè)，67例(32.2％)為陽(yáng)性，141例(67.8％)為陰性；熒光定量PCR檢測(cè)，74例(35.6％)表現(xiàn)為HER2過表達(dá)，擴(kuò)增倍數(shù)從2.0至80.0，其中，41例(1

7、9.7％)為2-10倍，16例(7.7％)為10-50倍，17例(8.2％)大于50倍。PCR(+)/IHC(+)：59例，PCR(+)/IHC(-)：15例，PCR(-)/IHC(+)：27例，PCR(-)/IHC(-)：107例；PCR(+)/FISH(+)：62例，PCR(+)/FISH(-)：12例，PCR(-)/FISH(+)：5例，PCR(-)/FISH(-)：129例，無顯著差異。結(jié)論：建立的Real-timePCR檢測(cè)乳