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文檔簡介
1、從20世紀70年代末開始,全球乳腺癌的發(fā)病率呈持續(xù)上升趨勢。2014年美國腫瘤學會在《腫瘤臨床醫(yī)生期刊》(A Cancer Journal for Clinicians)公布的數(shù)據(jù)顯示,乳腺癌依舊是女性人群中最為常見的癌癥。據(jù)其預計,乳腺癌將占女性所有新發(fā)腫瘤(Estimated New Cases)的四分之一左右,死亡率(Estimated Deaths)也僅次于肺癌,排名第二。中國雖然不是乳腺癌的高發(fā)國家,但近年來發(fā)病率卻一直處于高
2、位。截至2008年,中國乳腺癌新發(fā)數(shù)量占全世界的12.2%,死亡數(shù)量則占到了9.6%。尤其值得注意的是,我國乳腺癌患者的平均診斷年齡約為50歲,與西方女性的平均年齡(約為61歲)相比提前了約11年時間。由此可見,無論在西方國家還是在我國,乳腺癌都已成為女性最常見的、發(fā)病率最高的惡性腫瘤,而且在我國的發(fā)病年齡正趨于年輕化,嚴重影響著女性身心健康。
目前,乳腺癌的治療方法主要包括手術(shù)、化療、放療和分子靶向藥物治療等多種手段。其中,
3、分子靶向藥物的研發(fā)和應用最為迅速。依據(jù)人表皮細胞生長因子受體2(Human Epidermal growth factor Receptor-2,HER2)、雌激素受體(Estrogen Receptor,ER)和孕激素受體(Progesterone Receptor,PR)三種受體在乳腺癌細胞的不同表達水平,將乳腺癌分為四種不同的亞型,即Luminal A型、Luminal B型、HER2陽性和三陰型。HER2是一個與腫瘤發(fā)生密切相關(guān)
4、的細胞膜表面受體,它的高表達與乳腺癌患者的不良預后密切相關(guān)。經(jīng)統(tǒng)計顯示,有近1/4的乳腺癌患者屬于 HER2陽性,而這類患者的預后較差,且惡性程度較高。因此,針對 HER2受體的分子靶向藥物研究顯得尤為重要。美國Genentech公司研發(fā)了人源化HER2單克隆抗體--曲妥珠單抗(Trastuzumab,商品名:赫塞汀,Herceptin),因其聯(lián)合化療可以顯著延長HER2陽性轉(zhuǎn)移性乳腺癌的總生存期,于1998年獲得美國食品藥品監(jiān)督管理局
5、(Food and Drug Administration,F(xiàn)DA)批準上市,成為單克隆抗體類靶向藥物研究的里程碑。隨后,F(xiàn)DA又批準將 Trastuzumab第一個用于乳腺癌的新輔助治療。不幸的是,大部分HER2陽性患者在使用Trastuzumab治療1年左右會出現(xiàn)耐藥現(xiàn)象,進而導致腫瘤轉(zhuǎn)移復發(fā)。
拉帕替尼(Lapatinib)是葛蘭素史克公司(GlaxoSmithKline,GSK)研發(fā)的一種針對 HER2的新型小分子抑制
6、劑,它可以同時抑制 HER2和表皮生長因子受體(Epidermal Growth Factor Receptor,EGFR)胞內(nèi)段的ATP結(jié)合位點,阻斷下游增殖信號的傳遞,從而達到抗腫瘤的目的。2007年該藥被FDA批準應用于臨床,與卡培他濱(Capecitabine)合并治療晚期或復發(fā)性的乳腺癌,特別是已經(jīng)發(fā)生Trastuzumab耐藥的乳腺癌。臨床研究發(fā)現(xiàn),聯(lián)合應用Capecitabine和Lapatinib治療復發(fā)性晚期或轉(zhuǎn)移性乳
7、腺癌,可明顯延長疾病的進展時間(Time to Progression,TTP)和無疾病進展生存期(Progression-Free Survival,PFS)。這證明Lapatinib對進展期乳腺癌具有明顯的治療效果。研究表明,表皮生長因子(Epidermal Growth Factor,EGF)等配體與HER2受體結(jié)合后可以激活HER2信號轉(zhuǎn)導通路,誘發(fā)下游信號分子通路的級聯(lián)反應。HER2受體的活化可以誘導PI3K、Akt、mTOR
8、、p70SK等分子的活化,促使其發(fā)生磷酸化,加速腫瘤細胞的增殖。而Lapatinib則通過阻斷HER2下游促增殖信號的傳遞,抑制PI3K、Akt等分子活化和HER2陽性乳腺癌細胞的增殖,從而達到治療腫瘤的目的??墒?,臨床試驗顯示Lapatinib的臨床反應率僅有24%左右,獲益率也處于較低水平。原發(fā)性或獲得性耐藥嚴重制約著Lapatinib在臨床的應用,治療失敗的主要原因是產(chǎn)生耐藥,闡明其耐藥性機制并進行有效的干預,將有助于進一步提高該
9、藥的臨床應用價值。
自噬(Autophagy)是細胞在營養(yǎng)不足、藥物干預等極端條件下進行自我保護的重要機制之一。自噬可以促進細胞生存,但是過度的自噬卻促進細胞凋亡。因此,究竟“細胞自噬是促進還是抑制腫瘤細胞的存活”是一個充滿爭議的話題。近期有研究表明,細胞自噬可能參與腫瘤細胞獲得耐藥性的過程,而 PI3K/Akt/mTOR、LKBI/AMPK/mTOR等信號通路可能是細胞自噬發(fā)生的主要上游調(diào)控分子。同時,細胞中的活性氧類(Re
10、active Oxygen Species,ROS)與自噬也表現(xiàn)出密切的關(guān)系,參與到腫瘤細胞耐藥性的獲得過程中,激活耐藥細胞的ROS水平可能成為逆轉(zhuǎn)腫瘤耐藥的重要機制之一。
基于以上研究背景,我們試圖通過本課題的探索回答如下問題:(1)在HER2陽性乳腺癌細胞獲得Lapatinib耐藥性的過程中,細胞自噬是否發(fā)揮重要作用?(2)是否可以通過抑制細胞自噬過程恢復Lapatinib的治療敏感性?(3)細胞自噬活化的分子機制是什么?
11、(4)小檗堿(Berberine,BR)等藥物是否可以通過上調(diào)ROS水平殺傷Lapatinib耐藥細胞?通過解答以上問題,我們將明確HER2陽性乳腺癌細胞獲得Lapatinib耐藥性的機制,并為恢復Lapatinib的治療敏感性提供重要理論依據(jù)。
研究方法和結(jié)果:
1.具有Lapatinib耐藥性的HER2陽性細胞株的篩選及耐藥性分析:(1)利用Lapatinib處理HER2高表達的乳腺癌細胞系BT-474和AU-5
12、65,逐漸增加Lapatinib的作用濃度,維持篩選12個月,最終獲得具有Lapatinib耐藥性的細胞;(2)利用MTT、平板克隆和軟瓊脂克隆形成能力分析等方法對BT-474耐藥細胞(BT-474LapR)和AU-565耐藥細胞(AU-565LapR)的耐藥能力進行檢測。結(jié)果:所篩選的耐藥細胞經(jīng)過細胞增殖、平板克隆形成以及軟瓊脂克隆形成等多方面檢測均表現(xiàn)出穩(wěn)定的耐藥性,可以滿足后續(xù)機制研究的需要。
2.細胞自噬促進HER2陽
13、性細胞株獲得Lapatinib耐藥性的功能評價:(1)利用透射電鏡分析細胞自噬體是否在BT-474LapR和AU-565LapR細胞中增加;(2)用細胞自噬標記分子GFP-LC3融合蛋白轉(zhuǎn)染BT-474和AU-565細胞系,并用激光共聚焦顯微鏡觀察自噬體的分布變化;(3)利用MTT、EDU、平板克隆和流式細胞術(shù)等方法對BT-474LapR和AU-565LapR細胞進行檢測,觀察細胞的功能變化;(4)利用細胞自噬的抑制劑3-甲基腺嘌呤(3
14、-Methyladenine,3-MA)、氯喹(Chloroquine,CQ)和巴伐洛霉素A(Bafilomycin A,BA)聯(lián)合Lapatinib作用耐藥細胞,并進行細胞增殖能力和凋亡分析。結(jié)果:細胞自噬可以促進HER2陽性細胞株獲得Lapatinib耐藥性,抑制細胞自噬可以顯著增強耐藥細胞對Lapatinib的治療敏感性。
3.細胞自噬在Lapatinib耐藥細胞中活化的機制分析:(1)利用Western-blottin
15、g技術(shù)分析 AMPK-mTOR信號通路相關(guān)分子在BT-474Par和BT-474LapR細胞中的表達差異;(2)利用AMPK磷酸化的抑制劑Compound C阻斷AMPK下游信號通路,分析其對耐藥細胞功能的影響。結(jié)果:磷酸化AMPK在BT-474LapR細胞中的表達明顯增加,提示AMPK在耐藥細胞中處于活化狀態(tài),這可能是誘發(fā)細胞自噬的主要原因。Compound C阻斷AMPK下游信號通路后,LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ的轉(zhuǎn)化受到明顯的阻斷,細
16、胞水平的Lapatinib治療敏感性顯著增加。
4. Lapatinib耐藥細胞的ROS狀態(tài)分析及BR干預研究:(1)利用MTT、EdU、流式細胞術(shù)等方法檢測Lapatinib和/或BR對BT-474LapR細胞增殖和凋亡功能的影響;(2)利用ROS試劑盒檢測BR對BT-474Par和BT-474LapR細胞ROS水平的影響。結(jié)果:利用DCFH-DA標記和流式細胞術(shù)分析,發(fā)現(xiàn)BT-474LapR細胞的ROS水平顯著低于 BT-
17、474Par細胞。BR可以通過上調(diào) ROS水平顯著增加耐藥細胞對Lapatinib的治療敏感性,并誘導耐藥細胞凋亡。
結(jié)論:
1.所篩選的Lapatinib耐藥乳腺癌細胞系BT-474和AU-565具有穩(wěn)定的耐藥性;
2. Lapatinib耐藥細胞的自噬形成能力增加,并促進 HER2陽性細胞獲得 Lapatinib耐藥性;
3.利用自噬抑制劑阻斷耐藥細胞的自噬過程有助于恢復耐藥細胞對 Lapat
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