BAG-1基因與乳腺癌TAM治療敏感性的相關(guān)性研究.pdf

1、目的
　　 他莫昔芬作為乳腺癌內(nèi)分泌治療的代表藥物被廣泛用于治療早期及晚期雌激素受體和\或孕激素受體陽性的乳腺癌患者。它能顯著提高乳腺癌患者無復(fù)發(fā)生存率及總存活率，并能降低對(duì)側(cè)乳腺癌的發(fā)病率。然而有數(shù)據(jù)顯示，約有30-50％雌激素受體陽性的乳腺癌患者對(duì)他莫昔芬并不敏感。有學(xué)者提出，在乳腺癌的內(nèi)分泌治療中，除了目前已經(jīng)明確的靶點(diǎn)外，可能尚存在其他的重要分子與雌激素、孕激素相互作用，共同影響他莫昔芬治療的效果。BAG-1是一種具有促

2、進(jìn)細(xì)胞存活作用的抗凋亡基因，其蛋白參與細(xì)胞凋亡，信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞增殖及基因轉(zhuǎn)錄等多條調(diào)節(jié)通路。有多項(xiàng)研究報(bào)道BAG-1高表達(dá)可抑制乳腺癌細(xì)胞凋亡，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對(duì)缺氧、輻射、化療藥物等刺激的耐受性，與腫瘤細(xì)胞耐藥有關(guān)。更有研究顯示，乳腺癌組織中BAG-1蛋白的表達(dá)與接受他莫昔芬治療的乳腺癌患者預(yù)后顯著相關(guān)。本課題擬通過多種實(shí)驗(yàn)方法探討B(tài)AG-1與乳腺癌細(xì)胞對(duì)他莫昔芬藥物敏感性的關(guān)系，探討B(tài)AG-1在乳腺癌他莫昔芬治療中的作用，為乳腺癌內(nèi)分泌

3、治療敏感人群的篩選及療效的預(yù)測(cè)提供新的分子指標(biāo)。
　　 方法
　　 1、為了檢測(cè)他莫昔芬耐藥乳腺癌細(xì)胞及敏感乳腺癌細(xì)胞中BAG-1的表達(dá)水平差異，我們通過將人乳腺癌他莫昔芬敏感細(xì)胞MCF-7持續(xù)培養(yǎng)在含有低濃度4-OH TAM的培養(yǎng)液中，建立人乳腺癌他莫昔芬耐藥細(xì)胞TAMR/MCF-7。并在不同濃度4-OH TAM作用下，通過MTT測(cè)細(xì)胞存活率、AnnexinV-FITC/PI雙染色法檢測(cè)細(xì)胞凋亡、流式細(xì)胞術(shù)測(cè)細(xì)胞周期等

4、方法檢驗(yàn)TAMR/MCF-7細(xì)胞的耐藥特性;
　　 2、采用real-time PCR和westem blot方法對(duì)耐藥細(xì)胞及敏感細(xì)胞中BAG-1基因在mRNA和蛋白水平的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，初步分析其表達(dá)水平與乳腺癌細(xì)胞對(duì)TAM敏感性的關(guān)系，檢測(cè)兩株細(xì)胞中ER表達(dá)水平的差異，分析耐藥細(xì)胞中的耐藥特性的產(chǎn)生是否與ER表達(dá)的丟失相關(guān);
　　 3、設(shè)計(jì)合成3對(duì)BAG-1基因的siRNA，采用脂質(zhì)體試劑轉(zhuǎn)染乳腺癌細(xì)胞MCF-7，利用

5、real-time PCR和western blot檢測(cè)siRAN干擾后BAG-1基因的沉默效果，并篩選干擾效果較好的siRNA以及適宜的轉(zhuǎn)染濃度，用于下一步實(shí)驗(yàn);
　　 4、使用siRNA干擾乳腺癌細(xì)胞中BAG-1的表達(dá)水平。通過MTT測(cè)細(xì)胞存活率、AnnexinV-FITC/PI雙染色法檢測(cè)細(xì)胞凋亡、流式細(xì)胞術(shù)測(cè)細(xì)胞周期等方法檢測(cè)BAG-1基因表達(dá)下調(diào)后乳腺癌細(xì)胞對(duì)他莫昔芬的敏感性變化;
　　 5、使用重組載體pCR

6、3.1/BAG-1 p50，pCR3.1/BAG-1 p46，pCR3.1/BAG-1 p33分別轉(zhuǎn)染乳腺癌細(xì)胞株，使其BAG-1各亞型的表達(dá)水平分別上調(diào)，轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，real-time PCR和western blot檢測(cè)重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞后BAG-1基因各亞型的表達(dá)情況。并通過MTT測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率、AnnexinV-FITC/PI雙染色法檢測(cè)細(xì)胞凋亡、流式細(xì)胞術(shù)測(cè)細(xì)胞周期等方法檢測(cè)BAG-1基因各亞型表達(dá)上調(diào)后乳腺癌細(xì)胞對(duì)他莫昔

7、芬的敏感性變化。
　　 結(jié)果
　　 1、經(jīng)過6個(gè)月低濃度的他莫昔芬持續(xù)誘導(dǎo)，初步建立人乳腺癌他莫昔芬耐藥細(xì)胞（TAMR/MCF-7）。倒置顯微鏡下可觀察他莫昔芬耐藥細(xì)胞（TAMR/MCF-7）和敏感細(xì)胞(MCF-7)形態(tài)學(xué)上差異明顯;在相同濃度4-OH TAM作用下，TAMR/MCF-7細(xì)胞的存活率顯著高于MCF-7細(xì)胞，提示相同濃度的4-OH TAM對(duì)耐藥細(xì)胞的增值抑制作用明顯弱于其對(duì)敏感細(xì)胞的作用。藥物作用下MCF-

8、7細(xì)胞的存活率較低、凋亡比率顯著高于TAMR/MCF-7細(xì)胞，且MCF-7細(xì)胞中被阻滯于G0/G1期的細(xì)胞比例顯著高于TAMR/MCF-7細(xì)胞。
　　 2、BAG-1在他莫昔芬耐藥細(xì)胞TAMR/MCF-7和敏感細(xì)胞MCF-7中均有表達(dá)，在耐藥細(xì)胞中的表達(dá)水平顯著高于其在敏感細(xì)胞中的表達(dá)。而兩株細(xì)胞中ERα的表達(dá)水平未見顯著變化。
　　 3、與空質(zhì)粒對(duì)照組相比，3對(duì)不同的siRNA轉(zhuǎn)染組BAG-1表達(dá)在mRNA及蛋白水平均

9、有明顯下降，篩選其中干擾效率最高的siRNA序列轉(zhuǎn)染TAMR/MCF-7細(xì)胞。比較siRNA轉(zhuǎn)染組與空質(zhì)粒對(duì)照組對(duì)4-OH TAM的敏感性發(fā)現(xiàn)，在4-OHTAM作用下，兩株細(xì)胞的存活率差異明顯，且差異隨著藥物濃度的增大而增加，在10nM、100 nM時(shí)，兩株細(xì)胞的細(xì)胞存活率差異最為顯著。100nM4-OH TAM處理48小時(shí)后，BAG-1降表達(dá)組與空白對(duì)照組細(xì)胞凋亡率差異顯著。
　　 4、脂質(zhì)體法分別轉(zhuǎn)染含有各BAG-1亞型的三

10、個(gè)重組質(zhì)粒至乳腺癌細(xì)胞MCF-7中，轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的BAG-1各亞型在mRNA及蛋白水平的表達(dá)均明顯高于對(duì)照組。MTT及AnnexinV-FITC/PI雙染色法測(cè)凋亡結(jié)果顯示，只有轉(zhuǎn)染了BAG-1 p50的MCF-7細(xì)胞對(duì)4-OH TAM的敏感性降低，4-OH TAM作用下細(xì)胞存活率較空質(zhì)粒對(duì)照組多，而凋亡比率較空質(zhì)粒對(duì)照組少，流式細(xì)胞術(shù)測(cè)細(xì)胞周期結(jié)果顯示亦只有轉(zhuǎn)染了BAG-1 p50的MCF-7細(xì)胞被阻滯于G0/G1期的細(xì)胞比率較對(duì)照組減

11、少。而轉(zhuǎn)染了BAG-1其他亞型基因的細(xì)胞對(duì)4-OH TAM的敏感性未見明顯改變。
　　 結(jié)論
　　 該研究發(fā)現(xiàn)TAM耐藥乳腺癌細(xì)胞中BAG-1表達(dá)水平顯著高于其在敏感細(xì)胞的表達(dá)。增高乳腺癌細(xì)胞中BAG-1 p50亞型的表達(dá)，可抑制由TAM誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)TAM的耐藥性。然而其他亞型的擴(kuò)增表達(dá)并不能減弱TAM誘導(dǎo)的乳腺癌細(xì)胞凋亡。提示BAG-1不同亞型對(duì)TAM耐藥性的影響不同，可能與BAG-1 p50特異的N末端