RAD51C基因與Eμ-Myc p19Arf---細胞藥物敏感性及其表達在乳腺癌中的臨床意義.pdf

1、研究背景：
　　 同源重組(homologous recombination，HR)是細胞中的一項基礎生命活動，在維持細胞基因組完整性，修復內(nèi)源或外源性原因造成的DNA雙鏈損傷(double-strandbreak，DSB)中起重要作用。細胞在發(fā)生DSB時，主要依靠兩種方式進行修復，一種是同源重組修復(homologous recombination repair, HRR)，另一種是非同源末端連接(non-homologous

2、 end joining，NHEJ)。HR作為一種無差錯的修復方式，是絕大多數(shù)細胞生命活動所必須的。
　　 RAD51C是DNA損傷修復(DNA damage response，DDR)過程中的一個重要角色，將DNA損傷信號傳遞到下游并保證了HR參與損傷的修復。在DNA損傷發(fā)生后數(shù)分鐘內(nèi)，RAD51C在RAD51聚集之前即定位到損傷處，提示RAD51C在參與了HR早期的反應。同時，DNA損傷時ATM磷酸化激活下游CHK2蛋白的過

3、程，需要RAD51C的參與，從而阻滯細胞周期，引起DNA修復或凋亡等反應。該研究還發(fā)現(xiàn)，DNA損傷后，RAD51C聚集形成的焦點到RAD51焦點消失后仍然持續(xù)存在，提示RAD51C可能在HR的后期也發(fā)揮作用。另外許多研究也證實了RAD51C在HR后期中的重要作用。比如RAD51C參與了HR中Holliday交叉(Holliday Junction，HJ)的分支遷移和拆分。研究也發(fā)現(xiàn)，在鼠胚胎成纖維細胞(mouse embryonic f

4、ibroblasts，MEFs)中敲除RAD51C基因后HJ拆分活動顯著減少。
　　 由于HR通路在DNA損傷修復中起到關鍵性作用，可以預見，HR相關基因的突變將會導致無法修復的DNA損傷的積累，并因此引起細胞癌變，最終導致腫瘤發(fā)生。研究發(fā)現(xiàn)，RAD51C基因突變增加了乳腺癌和卵巢癌的發(fā)病風險。此外，RAD51C基因突變還與范科尼貧血(Fanconi anemia，F(xiàn)A)樣疾病的發(fā)病相關。
　　 鑒于RAD51C基因在D

5、NA損傷修復中的重要作用，本課題研究了RAD51C基因表達狀態(tài)對腫瘤細胞及乳腺癌患者的影響。實驗共分為三個部分:第一部分，利用RAD51C基因敲減的Eμ-Myc p19Arf-/-鼠淋巴瘤細胞，用三十余種常用抗腫瘤藥物作用于該細胞，篩選出RAD51C基因敲減后對其藥物敏感性影響較大的藥物;第二部分，利用PARP-1抑制劑奧拉帕尼作用于RAD51C基因敲減的Eμ-Myc p19Arf-/-鼠淋巴瘤細胞，觀察奧拉帕尼對該細胞周期及凋亡的影響

6、;第三部分，利用我科前期建立的組織芯片庫，通過免疫組化的方法研究人乳腺癌和癌旁組織中RAD51C蛋白表達情況，并對其表達與乳腺癌臨床病理學特征的相關性進行了探討。
　　 第一部分RAD51C基因表達抑制對抗腫瘤藥物在鼠Eμ-Mycp19Arf-/-細胞中作用的影響
　　 目的:通過逆轉(zhuǎn)錄病毒載體靶向抑制Eμ-Myc p19Arf-/-鼠淋巴瘤細胞中RAD51C基因的表達，在30余種藥物中篩選出RAD51C基因敲減后對其藥

7、物敏感性影響較大的藥物。
　　 方法:利用RAD51C-shRNA逆轉(zhuǎn)錄病毒載體感染Eμ-Myc p19Arf-/-細胞株，構建RAD51C基因穩(wěn)定敲減的Eμ-Myc p19Arf-/-細胞系。用30余種藥物作用于該細胞系，采用以流式細胞儀為基礎的GFP競爭測定方法在Eμ-Myc p19Arf-/-細胞系中對RAD51C基因敲減前后30余種藥物的作用進行比較。
　　 結果:用RAD51C-shRNA逆轉(zhuǎn)錄病毒載體感染Eμ

8、-Myc p19Arf-/-細胞可以有效降低該細胞內(nèi)RAD51C基因的表達。RAD51C基因沉默的細胞在CPT, DDP,17-AAG和olaparib等藥物作用后死亡率高于RAD51C正常表達的細胞。
　　 結論:RAD51C基因敲減后，會增加Eμ-Myc p19Arf-/-細胞對CPT, DDP,17-AAG和olaparib等藥物的敏感性。
　　 第二部分奧拉帕尼對RAD51C基因敲減的鼠Eμ-Myc p19Arf

9、-/-細胞DNA損傷及周期、凋亡的影響
　　 目的:通過western blot檢測奧拉帕尼作用后細胞內(nèi)γ-H2AX表達水平變化，流式細胞儀檢測奧拉帕尼對RAD51C基因敲減的鼠Eμ-Myc p19Arf-/-細胞周期及凋亡的影響。
　　 方法:利用RAD51C-shRNA逆轉(zhuǎn)錄病毒載體感染Eμ-Myc p19Arf-/-細胞株，構建RAD51C基因穩(wěn)定敲減的Eμ-Myc p19Arf-/-細胞系。用一定濃度的奧拉帕尼作

10、用于該細胞，一定時間后利用western blot檢測奧拉帕尼作用后細胞內(nèi)γ-H2AX表達水平變化，并用流式細胞儀檢測該細胞周期分布及凋亡的變化。
　　 結果:奧拉帕尼作用后，細胞內(nèi)γ-H2AX表達明顯增高，并且RAD51C基因敲減的Eμ-Myc p19Arf-/-細胞中γ-H2AX增高較RAD51C正常表達的細胞明顯;RAD51C正常表達及基因敲減的Eμ-Myc p19Arf-/-細胞處于早期S期的比例增多，提示細胞被阻滯在S

11、期;并且兩種細胞在奧拉帕尼作用后早期和晚期凋亡率均明顯增加，RAD51C敲減的Eμ-Myc p19Arf-/-細胞早期凋亡率及晚期凋亡率均高于RAD51C正常表達的細胞。
　　 結論:奧拉帕尼作用后會使Eμ-Myc p19Arf-/-細胞內(nèi)累積DSB，并使RAD51C敲減的Eμ-Myc p19Arf-/-細胞周期阻滯在S期，繼而引起細胞凋亡。
　　 第三部分乳腺癌組織中RAD51C蛋白的表達及其臨床意義
　　 目

12、的:通過免疫組化的方法研究人乳腺癌和癌旁組織中RAD51C蛋白表達情況，并對其表達與乳腺癌臨床病理學特征的相關性進行探討。
　　 方法:收集213例乳腺癌和99例癌旁組織的手術標本，制作乳腺癌組織芯片，利用免疫組化技術研究RAD51C在乳腺癌及癌旁組織中的表達情況及其臨床意義。
　　 結果:乳腺癌及癌旁組織中RAD51C表達無顯著差異。RAD51C蛋白陽性表達率在HER2表達陽性的患者中明顯高于HER-2表達陰性患者，其