Cre-loxP位點(diǎn)特異性重組酶系統(tǒng)聯(lián)合SV40LTAg誘導(dǎo)人黑素細(xì)胞可逆性永生化.pdf

1、白癜風(fēng)是一種常見的后天性局部脫色素性皮膚病，據(jù)國(guó)內(nèi)外統(tǒng)計(jì)其發(fā)病率約為0.5～2％，且有逐年增高趨勢(shì)。白癜風(fēng)的病因和發(fā)病機(jī)制尚未明確，病理表現(xiàn)為皮損局部表皮和毛囊中的黑素細(xì)胞(melanocytes，MC)減少或缺失，從而使黑素合成減少或缺失，臨床表現(xiàn)為境界清楚的色素脫失斑。近年來，國(guó)外學(xué)者研究表明，白癜風(fēng)患者皮損局部和全身均可檢測(cè)到針對(duì)MC表面抗原的自身抗體和細(xì)胞毒性CD8+T細(xì)胞，認(rèn)為白癜風(fēng)是一種自身免疫性脫色素性皮膚病。白癜風(fēng)的治療

2、比較困難，目前有很多治療方法，主要包括光化學(xué)治療、內(nèi)服藥物治療、外用藥物治療以及外科治療，前三種治療方法都存在療效個(gè)體差異大、副作用大等不足，外科治療主要包括自體表皮移植、自體MC移植和異體MC移植等方法，其中自體MC移植是療效最肯定、副作用最小的方法，因而外科治療已經(jīng)成為白癜風(fēng)治療研究的熱點(diǎn)。 目前臨床應(yīng)用于移植治療的MC主要來源于患者自身正常皮膚分離的MC體外培養(yǎng)。成人表皮中MC含量極少，只占表皮細(xì)胞的2％左右，正常情況下體

3、外培養(yǎng)的MC生長(zhǎng)緩慢、增殖能力極為有限，常需使用促M(fèi)C生長(zhǎng)因子如經(jīng)典的霍亂毒素(choleratoxin，CT)、十四烷酰佛波醇乙酯(12-o-tetradecanoylphorbol-13-acetate，TPA)以及近年逐漸被重視的堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(basicfibroblastgrowthfactor，bFGF)、轉(zhuǎn)鐵蛋白、氫化可的松、牛垂體提取物等。我們應(yīng)用黑素細(xì)胞專用培養(yǎng)基M254及添加劑HMGS(包含TPA、bFGF、

4、轉(zhuǎn)鐵蛋白、氫化可的松和牛垂體提取物等)，進(jìn)行成人正常表皮MC的分離與培養(yǎng)，經(jīng)系列生物學(xué)鑒定細(xì)胞表型和生物學(xué)功能正常，同時(shí)觀察到MC體外傳代最多不超過10代，能得到的MC數(shù)量有限，遠(yuǎn)不能滿足臨床移植治療所需，極大地限制了MC移植治療的臨床應(yīng)用。因此，MC的來源已經(jīng)成為白癜風(fēng)及其它脫色素性皮膚病外科治療發(fā)展的瓶頸，需要積極探索MC體外大量培養(yǎng)的有效方法和途徑，為自體MC移植提供安全、有效且可大量反復(fù)使用的移植供體。 組織工程學(xué)的原理

5、是利用人工的功能性組織替代功能障礙的器官或組織，其中，細(xì)胞移植尤其是自體細(xì)胞移植是目前應(yīng)用較廣泛的方法。我們?cè)O(shè)想如果能利用組織工程學(xué)的原理和方法在體外建立白癜風(fēng)患者的自體MC庫(kù)，得到在體外可大量增殖的自體MC，則可能解決白癜風(fēng)MC移植的細(xì)胞來源。常用的誘導(dǎo)細(xì)胞永生化的方法有原代培養(yǎng)細(xì)胞自發(fā)永生化、端粒酶亞單位hTERT誘導(dǎo)細(xì)胞永生化和轉(zhuǎn)基因技術(shù)誘導(dǎo)細(xì)胞永生化。通過比較上述方法的利弊，我們選擇利用外源SV40TAg基因誘導(dǎo)細(xì)胞永生化。為了

6、避免SV40TAg中stAg(smalltantigen)既可誘導(dǎo)細(xì)胞轉(zhuǎn)化也可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的雙重作用，我們用SOE法成功亞克隆出切除內(nèi)含子(編碼stAg)的SV40LTAg(largeTantigen)基因全長(zhǎng)，并在其兩端連接兩個(gè)同向的loxP序列，構(gòu)建了細(xì)胞永生化載體SV40LTAg-EGFP-loxP-reo。利用SofastTM基因轉(zhuǎn)染技術(shù)，將外源的SV40LTAg基因?qū)肱囵B(yǎng)的原代MC中，使外源基因穩(wěn)定整合并表達(dá)而獲得永生化黑素

7、細(xì)胞系(MCT)，在體外可長(zhǎng)期穩(wěn)定傳代(現(xiàn)已傳至45代)。對(duì)傳至第30代的MCT-5進(jìn)行了細(xì)胞生物學(xué)性狀及功能的鑒定、SV40LTAg基因的整合與表達(dá)及致瘤性分析，結(jié)果表明MCT-5(P30)穩(wěn)定整合并表達(dá)SV40LTAg，具有與正常原代MC大部分相似的生物學(xué)功能和細(xì)胞表型。 由于導(dǎo)入的是外源性的原癌基因SV40LTAg，可能使細(xì)胞的一些生物學(xué)性狀發(fā)生改變，我們的研究結(jié)果表明MCT具有一定的懸浮生長(zhǎng)能力，說明MCT具有了一些原代

8、細(xì)胞所不具備的轉(zhuǎn)化細(xì)胞表型，雖然經(jīng)染色體分析和裸鼠實(shí)驗(yàn)觀察細(xì)胞并無致瘤性，但其生物學(xué)安全性也受到一定質(zhì)疑。因此，我們利用基因打靶技術(shù)原理，引入位點(diǎn)特異性重組酶系統(tǒng)，去除導(dǎo)入的外源基因SV40LTAg。Cre/loxP位點(diǎn)特異性重組酶系統(tǒng)是由屬于Int家族的Cre位點(diǎn)特異性重組酶和其特定作用位點(diǎn)loxP構(gòu)成，此系統(tǒng)具有高度保守性和特異性，能定時(shí)、定位地根據(jù)loxP位點(diǎn)的位置切除特定基因。我們用Lipofectamine2000將pQCXI

9、P-NLS-iCre-ERTT2逆轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)染包裝細(xì)胞PA317，Puro選擇培養(yǎng)獲得PA317-Cre單克隆，經(jīng)NIH3T3測(cè)定病毒滴度為1×104CFU/ml(Puro抗性)。用此病毒上清感染MCT(感染細(xì)胞命名為MCT-C)，經(jīng)Puro篩選和tamoxifen誘導(dǎo)Cre重組酶表達(dá)，根據(jù)其作用靶點(diǎn)loxP，切除兩個(gè)同向loxP位點(diǎn)之間的SV40LTAg-EGFP基因，分別對(duì)Cre重組酶作用第6天和第10天的MCT-C進(jìn)行PCR、

10、RT-PCR、Westernblotting及免疫組化檢測(cè)，結(jié)果表明Cre重組酶的切除效率隨作用時(shí)間延長(zhǎng)而增加，到第10天時(shí)，已檢測(cè)不到SV40LTAg基因的表達(dá)，切除率可達(dá)100％。經(jīng)生物學(xué)鑒定和致瘤性分析表明，MCT-C經(jīng)Cre酶根據(jù)loxP位點(diǎn)發(fā)生重組后，細(xì)胞表型完全恢復(fù)原代細(xì)胞表型，具有正常的黑素合成功能，無致瘤性和懸浮生長(zhǎng)能力。 為了進(jìn)一步觀察所建立的可逆性永生化MC(MCT-C)的在體存活率和復(fù)色效果，我們選擇豚鼠用

11、過氧化氫化學(xué)脫色法建立白癜風(fēng)動(dòng)物模型，進(jìn)行了MCT-C和原代MC的細(xì)胞移植實(shí)驗(yàn)，按照白癜風(fēng)MC移植方法，在建立的白癜風(fēng)動(dòng)物模型上誘發(fā)表皮內(nèi)水皰，進(jìn)行細(xì)胞移植，觀察MCT-C和MC移植后的存活率及復(fù)色效果。為避免人源性MC可能作為抗原刺激豚鼠產(chǎn)生排斥反應(yīng)導(dǎo)致移植失敗，同時(shí)用裸鼠進(jìn)行了相同條件的MCT-C和原代MC移植實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)：MCT-C和原代MC移植2周內(nèi)可見局部輕微炎癥反應(yīng)，3周后可消失，1個(gè)月后移植區(qū)可見色素沉著，連續(xù)觀察3

12、個(gè)月后，大部分移植區(qū)可見0.5～1cm的黑色斑片或褐色斑片，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)分析，MCT-C和原代MC移植成功率以及豚鼠和裸鼠移植成功率之間無顯著差異。病理觀察及Masson-Fontana黑素銀染色法結(jié)果可見移植區(qū)有散在MC和明顯黑素沉積，表明所建立的可逆性永生化MCT-C與原代MC具有相似的在體存活率及復(fù)色效果。 綜上所述，我們的研究結(jié)果表明用Cre/loxP系統(tǒng)聯(lián)合SV40LTAg可以成功地建立人源性、體外可大量增殖、具備正常