基于可逆性永生化人肝細(xì)胞的生物人工肝系統(tǒng)的評估和人工肝體外循環(huán)裝置的研發(fā).pdf

1、研究背景：
　　肝衰竭發(fā)生時，肝臟會喪失其正常的解毒、生物合成和生物轉(zhuǎn)化功能，其臨床特征包括：凝血酶原時間延長、肝性腦病和黃疸。根據(jù)是否存在已知的或未知的慢性肝病病史，不同致病因素所引起的肝衰竭可被劃分為兩大類：急性肝衰竭和慢加急性肝衰竭，兩者均伴隨著高病死率。迄今為止，肝臟移植仍然是治療終末期肝衰竭公認(rèn)的最終解決方案，但世界性的供體短缺使其在臨床實際應(yīng)用中受到限制。在這種背景下，有研究者致力于體外人工肝支持系統(tǒng)的研發(fā)，以期為肝衰

2、竭患者提供一種肝移植前的過渡治療手段，或者為自體肝臟的恢復(fù)贏得機會。
　　根據(jù)是否裝載具有代謝活性的肝細(xì)胞，人工肝支持系統(tǒng)可分為非生物人工肝和生物人工肝。盡管非生物人工肝有改善肝衰竭患者的生化指標(biāo)和臨床癥狀的作用，但其在改善患者預(yù)后方面尚未達(dá)到預(yù)期的效果。目前公認(rèn)的觀點是，僅具備解毒功能的非生物人工肝不足以對肝衰竭患者提供全面的支持治療，而在理論上，以載細(xì)胞生物反應(yīng)器為核心的生物人工肝可提供大部分乃至全部的肝功能支持[7，8，10

3、-16]。然而，我們不得不承認(rèn)，生物人工肝的發(fā)展還不成熟，距離常規(guī)臨床應(yīng)用仍有距離。迄今，只有兩篇文獻報道了生物人工肝治療治療的隨機對照臨床試驗，結(jié)果不如人意。在這種背景下，有學(xué)者認(rèn)為理想的體外人工肝支持系統(tǒng)應(yīng)該是載細(xì)胞生物反應(yīng)器和多種非生物人工肝治療手段的有機整合。
　　為研發(fā)基于這種理念的體外人工肝支持系統(tǒng)，我們必須從以下三方面著手：1)選擇合適的細(xì)胞源；2)設(shè)計制造能夠為肝細(xì)胞提供近似體內(nèi)環(huán)境的生物反應(yīng)器；3)研發(fā)新的體外循

4、環(huán)裝置，該裝置不僅可以控制載細(xì)胞的生物反應(yīng)器，還可控制現(xiàn)有的大多數(shù)非生物人工肝治療模式。
　　最近，本研究團隊設(shè)計制造了一種以裝載海藻酸鈉-殼聚糖(AC)微球包裹的原代豬肝細(xì)胞的漏斗形流化床式生物反應(yīng)器為核心的生物人工肝支持系統(tǒng)，并證明該系統(tǒng)可顯著延長D-氨基半乳糖誘導(dǎo)的急性肝衰竭豬的生存時間。然而，原代豬肝細(xì)胞有使患者罹患動物源性傳染病的潛在風(fēng)險。這促使我們?nèi)ふ乙环N更加適用于生物人工肝臨床治療的肝細(xì)胞源。近年來，本實驗室致力于

5、永生化肝細(xì)胞的研究。盡管這類細(xì)胞具有體外擴增能力，但猿猴病毒40大T抗原基因(SV40 LT)的持續(xù)表達(dá)具有潛在的致瘤風(fēng)險。為了解決這個問題，本團隊?wèi)?yīng)用他莫西芬介導(dǎo)的Cre/LoxP位點特異性重組，建立了一株可逆性永生化人肝細(xì)胞系(HepLi-4)，SV40 LT可以被程序性的切除。在此基礎(chǔ)上，以可逆性永生化人肝細(xì)胞為細(xì)胞源對大型動物進行生物人工肝治療的首次試驗得以開展。
　　困擾我們的另一個問題是，研究所用的人工肝治療用體外循環(huán)

6、裝置大多依賴進口。例如，評價漏斗形流化床式生物反應(yīng)器和HepLi-4細(xì)胞所用的體外循環(huán)裝置是日本旭化成株式會社制造的Plasauto-iQ。而且，目前國外相關(guān)設(shè)備的功能較單一。在這種背景下，本團隊進行人工肝治療用體外循環(huán)裝置的研發(fā)，該裝置應(yīng)不僅能夠控制血漿置換(PE)、血漿吸附(PA)、血液透析(HD)等目前臨床常規(guī)應(yīng)用的非生物人工肝治療模式和尚處于科研階段的生物人工肝治療(BAL)模式，而且，以上各種模式均可便捷的進行聯(lián)合或序貫應(yīng)用。

7、本研究擬初步構(gòu)建具備上述功能的原理機，為下一步的人工肝治療研究提供一個可靠的平臺。
　　第一部分基于可逆性永生化人肝細(xì)胞的生物人工肝系統(tǒng)的動物實驗評估
　　目的：
　　通過中國實驗小型豬急性肝衰竭模型，對以可逆性永生化人肝細(xì)胞(HepLi-4)為肝細(xì)胞源的生物人工肝系統(tǒng)進行評估。
　　方法：
　　表達(dá)他莫昔芬依賴性Cre重組酶的HepLi-4細(xì)胞在轉(zhuǎn)瓶中擴增后，通過在含有500nM的4-羥基他莫昔芬的培養(yǎng)液

8、中培養(yǎng)5-7切除SV40 LT基因。豬急性肝衰竭模型通過在無麻醉情況下靜脈推注D-氨基半乳糖(1.5g/kg)誘導(dǎo)。包裹HepLi-4細(xì)胞的海藻酸鈉.殼聚糖(AC)徼球通過一步法制備。15只急性肝衰竭豬分為以下三組：1)生物人工肝治療(BAL)組：實驗動物接受裝載微囊化的HepLi-4細(xì)胞的生物人工肝支持系統(tǒng)治療(n=5)；2)假治療(Sham BAL)組：即設(shè)備對照，實驗動物接入生物人工肝支持系統(tǒng)進行體外循環(huán)，但反應(yīng)器內(nèi)僅裝入無細(xì)胞A

9、C微囊(n=5)；3)急性肝衰竭(ALF)組：即基線對照，實驗動物僅接受監(jiān)護但不接受治療(n=5)。記錄以上三組實驗動物的生存時間以及三種干預(yù)過程前后實驗動物的血液生化參數(shù)。生物人工肝治療前后，進行微球完整性和細(xì)胞活力檢測，同時，進行微囊化HepLi-4細(xì)胞內(nèi)肝臟特異性基因的轉(zhuǎn)錄水平分析，正常成人肝組織作為對照。
　　結(jié)果：
　　干預(yù)后，相對于Sham BAL組和ALF組，BAL組動物的Fischer指數(shù)較高，血清間接膽紅素

10、相對低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。BAL組動物的平均生存時間長于兩個對照組，但差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義。經(jīng)歷人工肝治療后，進行微球完整性和細(xì)胞活力沒有出現(xiàn)顯著的下；同時，微囊化HepLi-4細(xì)胞內(nèi)肝臟特異性基因的轉(zhuǎn)錄水平得以保持，但其相對于正常成人肝組織存在明顯的變異。
　　結(jié)論：
　　盡管HepLi-4細(xì)胞在生物人工肝治療過程中發(fā)揮了一些對急性肝衰竭豬有益的代謝功能，但HepLi-4細(xì)胞尚不能作為人工肝治療用的理想細(xì)胞源。我們需要在

11、維持肝細(xì)胞分化的研究中付出更多的努力。
　　第二部分人工肝體外循環(huán)裝置的研發(fā)
　　目的：
　　構(gòu)建可以控制現(xiàn)有的大部分非生物人工肝治療模式和生物人工肝治療模式的人工肝體外循環(huán)裝置的原理機。
　　方法：
　　人工肝體外循環(huán)裝置的原理機包含非生物部分和生物部分。體外循環(huán)裝置的控制中樞由的工業(yè)用個人計算機，兩個串行通訊端口和一個外設(shè)部件互連標(biāo)準(zhǔn)(PCI)數(shù)字輸入/輸出(DIO)卡組成。體外循環(huán)裝置的大多數(shù)部件可通

12、過RS485總線得到整合。該裝置的軟件為用戶提供了操作指導(dǎo)和人機交流界面。同時，基于硬件和軟件設(shè)計，該裝置在運行過程中可實現(xiàn)實時狀態(tài)監(jiān)測和調(diào)節(jié)。此外，體外循環(huán)裝置運行過程中的所有參數(shù)值都會被自動記錄，便于事后分析。為了驗證我們的設(shè)計中，我們對該原理機進行了體外測試和動物實驗測試。
　　結(jié)果：
　　在體外測試和動物實驗測試中，體外循環(huán)裝置原理機的硬件和軟件在所有治療模式下均運行正常。該裝置中所有部件的功能都得到了驗證。此外，該