新型人源細(xì)胞混合型生物人工肝構(gòu)建和評價(jià).pdf

1、急性肝功能衰竭(acute liver failure ALF)是臨床急危重征之一,病情危重,進(jìn)展迅速,預(yù)后兇險(xiǎn),盡管近年來內(nèi)科綜合治療措施取得了較大進(jìn)展,患者病死率依然高達(dá)80％,是臨床亟待解決的難題。目前,唯一有效的治療是原位肝移植,然而,供體的日益短缺、圍手術(shù)期成本高和手術(shù)復(fù)雜,使得絕大多數(shù)患者得不到最有效的治療?；诖朔N前提下,國內(nèi)外學(xué)者設(shè)計(jì)、構(gòu)建了不同類型的人工肝系統(tǒng),希冀借助一種體外的機(jī)械、理化或者生物的裝置,清除患者體內(nèi)蓄

2、積的各種有害物質(zhì),補(bǔ)充必需物質(zhì),改善內(nèi)環(huán)境,暫時(shí)替代衰竭肝臟的部分功能,為肝臟再生創(chuàng)造條件,作為通向肝移植的橋梁,從而降低患者病亡率。
　　 經(jīng)過50余年的發(fā)展,目前人工肝治療技術(shù)已逐漸成熟,其發(fā)展過程中先后經(jīng)歷了人.動物血液透析、體外離體肝灌注、人-人交叉循環(huán)、游離肝細(xì)胞移植到肝細(xì)胞懸液透析、混合型型生物人工肝支持系統(tǒng)等。其中,混合型生物人工肝(hybrid bioartificial liver,HBAL)代表著人工肝的發(fā)展

3、方向。
　　 肝細(xì)胞作為HBAL的其核心原材料,對肝功能衰竭患者的肝支持作用幾乎完全依賴于所用肝細(xì)胞的生物學(xué)功能。肝細(xì)胞來源種類較多,但目前尚未有一種可以完全滿足臨床的需要,如人肝細(xì)胞來源的匾乏、胎肝細(xì)胞的倫理問題、肝細(xì)胞株的瘤源性等原因、豬肝細(xì)胞潛在的異種細(xì)胞免疫反應(yīng)、合成的蛋白質(zhì)種屬差異和豬體內(nèi)普遍存在著內(nèi)源性反轉(zhuǎn)錄病毒(procine endogenous retrviral,PERV)。我們的前期研究發(fā)現(xiàn),中國人肝細(xì)胞系

4、1細(xì)胞(CL—1 Cells)分化程度高且生物代謝功能良好,并且CL-1細(xì)胞組織學(xué)上來源于正常肝組織,較其他來源于腫瘤源性的肝細(xì)胞系更為安全,但是目前尚未對CL-1細(xì)胞作為種子細(xì)胞的HBAL進(jìn)行研究。
　　 HBAL的另一核心則是生物反應(yīng)器。理想的生物反應(yīng)器應(yīng)能為肝細(xì)胞提供較好的生長代謝環(huán)境,并達(dá)到較好的物質(zhì)交換目的。我研究所與中國科學(xué)院電工研究所共同研制了一種全接觸灌流型生物反應(yīng)器,其采用雙進(jìn)口和雙出口的透明有機(jī)塑料制成,進(jìn)行

5、治療時(shí)能做180度的往返旋轉(zhuǎn)運(yùn)動,生物反應(yīng)器中的肝細(xì)胞與血漿直接接觸,可以充分的發(fā)揮肝細(xì)胞的代謝和生物轉(zhuǎn)化功能,并且生物反應(yīng)器有獨(dú)立的供給氧氣的裝置,氧氣通過膜式氧合器進(jìn)入血清中,供給反應(yīng)器中的肝細(xì)胞,以保證生物反應(yīng)器中的肝細(xì)胞得到充分的氧氣供應(yīng)。
　　 本研究中,我們以這種全接觸灌流型生物反應(yīng)器接種微載體微重力CL-1細(xì)胞,結(jié)合非生物部分的膜型血漿分離器、血漿灌流器、蠕動泵等構(gòu)建了一種簡單、新穎的人源細(xì)胞混合型生物人工肝,并用

6、食蟹猴急性肝功能衰竭模型對其進(jìn)行安全性及有效性評價(jià)。具體包括以下兩部分研究內(nèi)容:
　　 一:食蟹猴急性肝功能衰竭模型的建立；
　　 二:新型人源細(xì)胞混合型生物人工肝的安全性及有效性評價(jià)。
　　 第一部分:食蟹猴急性肝功能衰竭模型的建立
　　 目的:構(gòu)建一種穩(wěn)定的具有潛在可逆性和良好重復(fù)性的非人靈長類大動物急性肝衰竭模型,為下一步開展新型人源細(xì)胞混合型生物人工肝的安全性與有效性評價(jià)奠定基礎(chǔ)。
　　

7、方法:選取雄性食蟹猴作為模型動物。15只食蟹猴隨機(jī)分為3組:第一組為高劑量組(n=5),給藥劑量為0.45g/kg；第二組為中等劑量組(n=5),給藥劑量為0.3g/kg；第三組為低劑量組(n=5),給予D-氨基半乳糖0.15g/kg。在速眠新Ⅱ和氯胺酮復(fù)合麻醉下把D-氨基半乳糖溶液經(jīng)頸外靜脈注入食蟹猴體內(nèi)。給藥后動態(tài)觀察肝功能、腎功能、血糖、血氨、凝血項(xiàng)、支鏈氨基酸和芳香族氨基酸比等,記錄動物存活時(shí)間。死亡動物立即尸檢,動物死后作詳細(xì)

8、尸檢并取肝臟、腎臟、脾臟、胰腺、心臟、肺、胃腸和腦組織標(biāo)本,光鏡及電鏡下觀察上述組織的病理學(xué)變化。
　　 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。計(jì)量資料以均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差((X)±S)表示,各指標(biāo)采用重復(fù)測量方差分析,生存時(shí)間采用Kaplan-Meier法。P≤0.05,有顯著性差異或差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果:高劑量組的平均存活時(shí)間是(56.1±8.1)h,有4/5的病食蟹猴死亡前出現(xiàn)肝昏迷,不能站立

9、。中劑量組的平均存活時(shí)間為(109.8±11.2)h,其中3/5的病食蟹猴出現(xiàn)肝昏迷。低劑量組以劑量為0.15g/kg D-氨基半乳糖胺引導(dǎo)的5只食蟹猴中,除1只98h后死亡外其余全部存活,在第4d開始好轉(zhuǎn),之后全部指標(biāo)漸恢復(fù)正常。中劑量組兩只食蟹猴的存活時(shí)間分別為105和120 h,血清的轉(zhuǎn)氨酶在給藥后12 h開始升高,并隨病程進(jìn)展越來越高,血中的膽紅素、膽酸、氨、乳酸也逐漸上升。而血小板則越來越低,凝血酶原時(shí)間越來越長。所有實(shí)驗(yàn)食蟹

10、猴的血液電解質(zhì)和酸堿度一直保持在正常的范圍內(nèi)。血?dú)夥治龅慕Y(jié)果也在正常范圍,沒有明顯的變化。直線相關(guān)分析顯示注射D—gal的動物存活時(shí)間與D-gal劑量呈顯著負(fù)相關(guān)。Kaplan-Meier生存分析表明各組實(shí)驗(yàn)猴生存時(shí)間比較,(X2=21.933,P<0.001)差異有顯著性。尸檢發(fā)現(xiàn)所有給予D-gal的動物肝臟體積縮小,邊緣變銳,表面色澤斑駁,散在針尖至米粒大小出血點(diǎn),肝臟切面有暗紅色淤血,黃色乳靡狀壞死物質(zhì)溢出,膽囊形態(tài)、大小正常,腸

11、管有輕度到中度脹氣,腸壁充血水腫,有散在出血點(diǎn),腎臟、脾臟、肺臟肉眼未見異常。腦組織重度水腫,以血管周圍間隙與星狀細(xì)胞周圍明顯。
　　 光鏡檢查發(fā)現(xiàn)對照組動物肝小葉結(jié)構(gòu)完整,無肝細(xì)胞壞死征象。而注射D-gal的動物均出現(xiàn)肝細(xì)胞片狀壞死,伴有明顯的出血,肝細(xì)胞彌漫性腫脹,肝竇受壓變窄。肝細(xì)胞胞漿疏松化、空泡變性,部分肝細(xì)胞內(nèi)可見脂肪空泡。部分肝細(xì)胞核碎裂、溶解。部分匯管區(qū)可見中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞浸潤。高劑量組的動物肝細(xì)胞呈現(xiàn)大片壞

12、死,肝小葉結(jié)構(gòu)不清,出血嚴(yán)重。電鏡檢查未注射D-氨基半乳糖胺時(shí),肝臟超微結(jié)構(gòu)示食蟹猴肝細(xì)胞胞漿內(nèi)糖原顆粒豐富,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)豐富無擴(kuò)張,線粒體豐富無腫脹,嵴清晰,線粒體膜清楚,細(xì)胞核染色質(zhì)均勻,核膜核仁清晰。注射D-氨基半乳糖胺時(shí),細(xì)胞漿內(nèi)糖原顆粒均質(zhì)化,粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脫顆粒,線粒體腫脹,嵴模糊,部分線粒體溶解,細(xì)胞間毛細(xì)膽管微絨毛減少明顯,細(xì)胞核染色質(zhì)集聚,核變形,核內(nèi)假包涵體形成。
　　 結(jié)論
　　 1.成功建立了D-gal誘導(dǎo)

13、的ALF模型及摸索出最佳藥物劑量；
　　 2.D-gal誘導(dǎo)的食蟹猴ALF模型具有與人類ALF相似的臨床、生化和病理學(xué)特征。
　　 3.D—gal誘導(dǎo)的食蟹猴ALF模型具有潛在可逆性和良好的重復(fù)性,動物死于ALF,且具有合適的治療時(shí)間“窗口”,適合應(yīng)用于人工肝臨床前評價(jià)研究。
　　 第二部分:新型人源細(xì)胞混合型生物人工肝安全性與有效性評價(jià)
　　 目的:本研究旨在設(shè)計(jì)一種新型人源細(xì)胞混合型生物人工肝,并通過

14、對食蟹猴急性肝功能衰竭的救治評價(jià)其安全性與有效性,探討其臨床應(yīng)用的可行性。
　　 材料和方法:整個(gè)HBAL的設(shè)計(jì)采用血漿灌流+生物人工肝模式,非生物部分通過血漿分離后進(jìn)入血液灌流器中,經(jīng)過灌流后的血液在通過蠕動泵部分進(jìn)入生物反應(yīng)器中,生物反應(yīng)器部分置于37.5℃的恒溫環(huán)境中,生物部分通過膜式氧合器供給反應(yīng)器中肝細(xì)胞,氧氣和二氧化碳?xì)怏w時(shí)間比約為110:10(即2分鐘內(nèi)通氧氣110s,通二氧化碳10s),食蟹猴肝衰竭血漿經(jīng)過肝細(xì)胞

15、代謝后,再通過二次分漿回流至非生物部分,整個(gè)系統(tǒng)的預(yù)沖量約為800ml.其中灌流型生物反應(yīng)器的預(yù)沖量約為300ml,整個(gè)系統(tǒng)通過旭化成血液凈化用血液回路和自制聚乙烯膠管構(gòu)成一個(gè)封閉的環(huán)路。
　　 選用中國人肝細(xì)胞系1(CL—1)作為肝細(xì)胞供體,采用微載體微重力肝細(xì)胞共培養(yǎng)方法培養(yǎng)至第五天,灌入反應(yīng)器中,制成生物部分(細(xì)胞總量約為2.0×109,細(xì)胞密度4.0×108/ml)。
　　 選取雄性食蟹猴(體質(zhì)量6.5～7 kg

16、)作為模型動物,采用D-gal0.3g/kg頸外靜脈注射法,誘發(fā)食蟹猴ALF模型。注射D-gal48h后,15只ALF食蟹猴隨機(jī)分成2組,即(1)ALF對照組(n=5):食蟹猴僅予水與食物,未給予任何治療措施:(2)HBAL治療組(n=10):動物接受HBAL治療6h,生物反應(yīng)器內(nèi)接種2.0×109 CL-1細(xì)胞。
　　 觀察治療期間循環(huán)管路密閉性,以及治療過程中不良反應(yīng)情況和混合型生物人工肝治療前、治療中及治療后觀察食蟹猴生命

17、體征變化；記錄動物生存時(shí)間,動態(tài)檢測天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶、白蛋白、總膽紅素、總膽汁酸、尿素氮、肌酐、血氨及計(jì)算Fischer指數(shù)等；食蟹猴死亡后立即作詳細(xì)尸檢并取肝臟、腎臟、脾臟、胰腺、心臟、肺、胃腸和腦組織標(biāo)本,光鏡及電鏡下觀察上述組織的病理學(xué)變化。此外,于HBAL治療開始前及結(jié)束后取樣計(jì)數(shù)反應(yīng)器中肝細(xì)胞數(shù)量和肝細(xì)胞的狀態(tài),MTT法檢測肝細(xì)胞活性。
　　 治療結(jié)束后,取二次分漿后培養(yǎng)液鏡檢,同時(shí)取生物反應(yīng)器中的CL-1細(xì)胞,以2.5

18、g/L胰蛋白酶消化后離心,加DMEM調(diào)至細(xì)胞密度為1.0×1010/L,-70℃反復(fù)凍溶三次,使細(xì)胞裂解,將0.2ml含細(xì)胞碎片的溶液分別接種到5只裸鼠的頸部、后背部皮下(n=10))。以0.2ml,密度為1.0×1010/L的CL-1細(xì)胞接種到5只裸鼠的頸部、后背部皮下(n=10),苔盼藍(lán)拒染試驗(yàn)計(jì)數(shù)活細(xì)胞率為97％,作對照,觀察皮下細(xì)胞致瘤情況。4周后切取注射部位瘤組織及肝、肺、腦組織標(biāo)本,蘇木精-伊紅(HE)染色鏡檢,觀察細(xì)胞形態(tài)

19、、排列及細(xì)胞核染色及是否有侵犯周邊組織等情況。
　　 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(X)±S表示。計(jì)量資料組間比較采用t檢驗(yàn)及重復(fù)測量數(shù)據(jù)的方差分析,組間生存率的比較采用X2檢驗(yàn)。動物存活時(shí)間采用Kaplan-Meier(KM)法生存分析及Log-Rank檢驗(yàn)。所有資料的分析均采用SPSS13.0 for Windows統(tǒng)計(jì)軟件。P≤0.05,有顯著性差異或差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果:10只進(jìn)行救治的急性肝衰

20、竭食蟹猴無一于治療過程中死亡。整個(gè)治療過程中未發(fā)現(xiàn)循環(huán)管路中有液體滲漏,未發(fā)生明顯的出血、過敏、高熱及其他嚴(yán)重的不良反應(yīng),耐受良好。生命體征監(jiān)測方面,除開始引血時(shí)出現(xiàn)一過性心率和血壓波動,治療全程心率、血氧飽和度、呼吸及平均動脈壓都能保持穩(wěn)定。
　　 治療結(jié)束后,HBAL治療組食蟹猴保持清醒,此后5只食蟹猴逐漸出現(xiàn)乏力、活動減少、反應(yīng)遲鈍、嗜睡、昏迷,并于注射D-gal108-123h后死亡。但與ALF對照組比較,HBAL治療組

21、食蟹猴無出現(xiàn)嘔吐、抽搐等嚴(yán)重消化道及神經(jīng)系統(tǒng)癥狀。
　　 HBAL治療組中5只食蟹猴存活,其余5只死亡,存活時(shí)間為128±3；ALF對照組食蟹猴全部死亡,存活時(shí)間為112±2。Kaplan-Meier(KM)法生存分析提示HBAL治療可顯著延長受試動物的生存時(shí)間(p<0.01)注射D-gal48h后,全部食蟹猴均出現(xiàn)血清天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶、總膽紅素、總膽汁酸、尿素氮、肌酐、血氨濃度急劇升高,白蛋白、Fischer指數(shù)顯著降低。HBA

22、L治療后,HBAL治療組血清天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶、總膽紅素、總膽汁酸、尿素氮、肌酐、血氨濃度明顯較ALF對照組降低。
　　 HBAL治療開始前CL-1細(xì)胞活度為97-99％,治療結(jié)束后,結(jié)束后CD-1細(xì)胞活度可保持為85-90％。
　　 二次分漿后取培養(yǎng)液鏡下未見CL-1細(xì)胞。CL-1細(xì)胞接種至裸鼠的頸部、后背部皮下后4周時(shí),實(shí)驗(yàn)組未見接種部位出現(xiàn)種植瘤,對照組共有10個(gè)接種部位出現(xiàn)腫瘤,致瘤率為100％。瘤體呈光滑的圓球型,

23、界限清楚,有完整的包膜,肝、肺、腦等組織器官中未發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移瘤。
　　 結(jié)論:
　　 1.構(gòu)建了一種新型灌流型生物反應(yīng)器。該生物反應(yīng)器中的CL-1細(xì)胞能夠保持較高的活性和良好的功能,同時(shí)CL—1細(xì)胞可以安全的作為HBAL細(xì)胞材料。
　　 2.構(gòu)建了一種新型混合生物型人工肝。該型人工肝可以顯著降低受試動物血清中天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶、總膽紅素、總膽汁酸、尿素氮、肌酐、血氨濃度,改善Fischer指數(shù),并延長動物存活時(shí)間,提示其