人源性生物人工肝的制備及臨床前研究.pdf

1、急性肝衰竭(acuteliverfailure，ALF)是病毒性肝炎一種危重的臨床綜合征，傳統(tǒng)支持治療病死率高達(dá)80％。肝移植是有效的ALF治療措施，但由于肝供體嚴(yán)重缺乏，許多患者在等待供體過(guò)程中死亡。生物人工肝支持系統(tǒng)(bioartificialliversupportsystem,BALSS)是未來(lái)最有希望在體外提供全面肝功能支持，使患者順利過(guò)渡到肝移植或肝再生的有效治療方法。BALSS的關(guān)鍵生物材料是肝細(xì)胞。雖然新鮮分離的豬肝細(xì)胞

2、和人肝細(xì)胞瘤細(xì)胞都曾經(jīng)被用作BALSS的細(xì)胞材料，但由于存在過(guò)敏反應(yīng)、病毒感染和誘發(fā)腫瘤等不安全因素，臨床應(yīng)用受到很大限制。我們應(yīng)用SV40Tag和端粒酶轉(zhuǎn)染原代人肝細(xì)胞建立了永生化人肝細(xì)胞系（immortalizedhumanhepatocytes，IHH）。前期研究表明，IHH表現(xiàn)高增殖活性，可在微載體上高密度培養(yǎng)，體內(nèi)不具有成瘤性。體外分析表明：IHH具有正常肝細(xì)胞的主要功能，表達(dá)與肝臟代謝、解毒、合成相關(guān)的基因和蛋白。將IHH與

3、肝衰竭血清孵育后，可使血清膽紅素進(jìn)行性地降低，尿素進(jìn)行性升高，表明IHH具有對(duì)膽紅素和血氨的解毒功能。
　　 目的：
　　 應(yīng)用微載體大規(guī)模培養(yǎng)IHH，構(gòu)建人源性生物人工肝(human-derivedbioartificialliver，hBAL)，通過(guò)對(duì)大量ALF血漿灌流解毒的體外實(shí)驗(yàn)和對(duì)小鼠ALF模型、恒河猴ALF模型治療的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，評(píng)價(jià)hBAL治療ALF的有效性和安全性，為hBAL進(jìn)入臨床Ⅰ期試驗(yàn)提供依據(jù)。

4、　　 方法：
　　 應(yīng)用微載體攪拌懸浮方法大規(guī)模高密度培養(yǎng)IHH。
　　 采用腹腔注射四氯化碳(CCl4)建立裸鼠ALF模型，將微載體培養(yǎng)IHH注射于裸鼠腹腔內(nèi)進(jìn)行腹膜透析治療，并設(shè)未治療組和空微載體治療組，比較各組動(dòng)物的肝功能損傷指標(biāo)，肝組織病理和動(dòng)物生存率。
　　 將微載體培養(yǎng)IHH和樹(shù)脂顆粒灌裝特制容器構(gòu)建IHH細(xì)胞反應(yīng)器，連接蠕動(dòng)泵，對(duì)400mLALF血漿灌流解毒6h，IHH細(xì)胞反應(yīng)器再生18h后，再次

5、進(jìn)行6h灌流解毒，解毒．再生循環(huán)6次，觀察ALF血漿膽紅素、尿素濃度變化，評(píng)價(jià)IHH細(xì)胞反應(yīng)器的體外解毒功能。
　　 用間隔48h兩次注射D-氨基半乳糖(D-galactosamine，D-GalN)的方法建立恒河猴ALF模型，IHH細(xì)胞反應(yīng)器連接血液凈化裝置制備hBAL，采用連續(xù)10h每5h更換新的IHH細(xì)胞反應(yīng)器的連續(xù)治療模式及治療5h，間隔19h，重復(fù)3次的間隔治療模式對(duì)兩只ALF恒河猴分別進(jìn)行了hBAL治療，觀察轉(zhuǎn)氨酶、

6、膽紅素、血氨、尿素、膽汁酸、血糖、凝血酶原時(shí)間、凝血酶原活動(dòng)度、纖維蛋白原等肝功能損傷指標(biāo)的變化及ALF恒河猴生存情況和不良反應(yīng)，評(píng)價(jià)hBAL對(duì)ALF的療效和安全性。死亡恒河猴肝組織切片HE染色觀察肝壞死情況。對(duì)IHH進(jìn)行了染色體分析及SCID鼠成瘤實(shí)驗(yàn)以評(píng)價(jià)其安全性。
　　 結(jié)果：
　　 采用微載體技術(shù)可大規(guī)模培養(yǎng)IHH，培養(yǎng)體積可達(dá)500～600mL。
　　 腹腔注射CCl4后24h，所有小鼠的轉(zhuǎn)氨酶升高達(dá)正

7、常值10倍以上。未治療組和空微載體治療組動(dòng)物48h內(nèi)全部死亡，肝組織檢查發(fā)現(xiàn)肝細(xì)胞廣泛壞死；而采用IHH-微載體治療組48h動(dòng)物生存率為83.3%，持續(xù)14d后轉(zhuǎn)為長(zhǎng)期存活。存活的動(dòng)物轉(zhuǎn)氨酶降至正常水平，肝組織檢查顯示肝細(xì)胞壞死顯著減少，免疫組織化學(xué)染色顯示腹腔微載體上肝細(xì)胞仍存活，并表達(dá)人肝細(xì)胞特異蛋白α1-抗胰蛋白酶(α1-antitrypsin,α1-AT).
　　 IHH細(xì)胞反應(yīng)器對(duì)ALF血漿灌流解毒6h后，可使血漿總膽

8、紅素下降18%，解毒-再生循環(huán)6次后，可使血漿總膽紅素下降41%；血漿尿素從解毒-再生循環(huán)第4次起升高，到第6次，總升高幅度為22%，而空微載體對(duì)照組ALF血漿相應(yīng)指標(biāo)無(wú)顯著變化。
　　 間隔48h兩次注射D-GalN可成功制備恒河猴ALF模型，恒河猴血清轉(zhuǎn)氨酶升高44倍，膽紅素升高5.4倍，血氨升高2.5倍，凝血酶原時(shí)間＞75秒，凝血酶原活動(dòng)度＜10%，未經(jīng)治療的恒河猴反應(yīng)遲鈍，進(jìn)食飲水減少，嘔吐，尿少，最長(zhǎng)生存時(shí)間不超過(guò)63

9、h。
　　 造模后48h開(kāi)始連續(xù)10h的hBAL治療可使恒河猴血液肝損傷指標(biāo)改善：轉(zhuǎn)氨酶下降70～80%;膽紅素下降約70%;血氨未繼續(xù)升高，而尿素水平增高；總膽汁酸(totalbileacid，TBA)下降約75%。治療終止后上述指標(biāo)反彈，到造模后4天為反彈高峰。凝血功能未改善，恒河猴生存7.6天。肝組織病理學(xué)檢查顯示與未治療ALF恒河猴比，肝壞死減輕，肝淤血減少。
　　 造模后24h開(kāi)始間隔hBAL治療3次，每次均使

10、轉(zhuǎn)氨酶下降約50%，治療終止后，轉(zhuǎn)氨酶反彈升高，但造模后4天的反彈高峰幅度較低，僅為連續(xù)治療的39%;間隔hBAL治療抑制了膽紅素升高，造模后4天的反彈幅度為連續(xù)治療的12%;間隔hBAL治療后尿素水平顯著升高，約為連續(xù)治療的一倍，同時(shí)血氨無(wú)顯著升高。間隔hBAL治療還抑制了TBA的升高，改善了凝血功能，造模后7天，凝血功能恢復(fù)正常。經(jīng)3次間隔hBAL治療后，ALF恒河猴痊愈而長(zhǎng)期存活。
　　 hBAL治療過(guò)程中設(shè)備運(yùn)行穩(wěn)定，各

11、項(xiàng)參數(shù)正常。不良反應(yīng)有低血壓和低血鈣，對(duì)癥治療后緩解。
　　 染色體分析示IHH為二倍體，IHH移植SCID鼠皮下和肝臟內(nèi)6個(gè)月未成瘤。
　　 結(jié)論：
　　 應(yīng)用微載體培養(yǎng)IHH可成功制備可再生性人源性生物人工肝。體外實(shí)驗(yàn)中可使400mLALF血漿膽紅素降低，血漿尿素增高，具有解毒功能。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中可使ALF小鼠和ALF恒河猴生存期延長(zhǎng)，肝損傷指標(biāo)改善，療效顯著，安全性好。對(duì)ALF恒河猴治療的間隔治療模式療效優(yōu)于連