臨床生物樣本前處理方法的研究及臨床應用意義.pdf

1、臨床治療藥物監(jiān)測（TDM），作為實現(xiàn)患者個體化治療的重要手段之一，其在臨床上的普及很好地保障了臨床患者用藥的安全性及有效性，有力地支持了精準醫(yī)療工作的開展。其中，對臨床生物樣本進行分析是實現(xiàn)TDM的重要手段之一。
　　無論是臨床生物樣本還是普通健康受試者生物樣本，其中都含有大量的內(nèi)源性大分子，使得分析結(jié)果易受基質(zhì)效應的影響，因此在分析前，往往需要對樣本進行適當?shù)厍疤幚?，將待測組份從生物樣品基質(zhì)中分離出來，以降低基質(zhì)效應的影響。目前

2、常用的生物樣本前處理方法主要有蛋白沉淀法（PPT）、液液萃取法（LLE）、固相萃取法（SPE）等，這些方法往往是使用健康志愿者的血漿進行方法學驗證，但是，臨床生物樣本的狀態(tài)與健康志愿者明顯不同，健康志愿者的生物樣本狀態(tài)相對穩(wěn)定，所造成的基質(zhì)效應變異度小，而臨床患者的生物樣本狀態(tài)往往因受疾病狀態(tài)的影響而變現(xiàn)出很大的個體差異，導致基質(zhì)效應差別顯著，因此，臨床樣本分析結(jié)果的準確性不易得到保障。有研究表明，臨床患者血液樣本的粘度、蛋白濃度、膠體

3、滲透壓等都極易受到疾病狀態(tài)的影響，表現(xiàn)出很大的變異性，而蛋白沉淀量、萃取效率等極易受到這些因素等影響，因此，在使用PPT、LLE或SPE處理不同臨床患者的血樣時，即便是加入的沉淀劑或萃取劑的量完全相同，也很容易導致待測物的回收率不同，從而影響分析結(jié)果的準確性。此外，傳統(tǒng)的生物樣本前處理方法檢測指標單一，通常僅能用于總藥物濃度（Ct）或游離藥物濃度（Cf）的檢測，而 Ct或 Cf易受到采樣時間、用藥時長、進食等因素的影響。在普通的生物樣本

4、研究中，這些因素都會被嚴格地控制，此時，測定的Ct或Cf可以較為準確地反應機體整體的用藥情況。但是，在對臨床患者進行研究或日常監(jiān)測時，患者的采樣點、進食時間、食物種類等，都不容易像非臨床生物樣本研究一樣被嚴格控制，因此，所測定得Ct或Cf可能很難真實地反應體內(nèi)藥物水平。同時傳統(tǒng)前處理方法還存在著操作復雜、耗時長等問題，對結(jié)果的準確性、分析效率造成影響。
　　由于傳統(tǒng)樣品前處理方法并未考慮到臨床樣本的特殊性，分析結(jié)果往往給臨床研究及

5、日常TDM帶來了許多困惑，甚至影響到患者的個體化治療效果。因此，建立簡便、準確、適當且免于疾病狀態(tài)干擾的臨床生物樣本前處理方法，是保障測定結(jié)果的準確性、測定指標的合理性、提高方法的普及性的關(guān)鍵因素，可為臨床生物樣本日常檢測以及藥物藥效學關(guān)系的研究提供可靠地分析平臺，更好地保證臨床患者用藥安全有效，提高治療效果，降低毒副反應。
　　第一部分：集血樣采集與處理于一體的新型生物樣品前處理方法
　　目的：將封閉技術(shù)與中空纖維超濾法（

6、FE-HFCF-UF）相結(jié)合，建立一個簡單、有效、免處理的生物樣品前處理方法，用于保障臨床生物樣本分析結(jié)果的真實性，同時提高了分析過程的生物安全性。
　　方法：以阿德福韋和替諾福韋為模型藥物，將封閉技術(shù)與直接進樣技術(shù)相結(jié)合，建立一個全封閉的中空纖維超濾技術(shù)。在負壓的作用下，約0.6 mL的全血樣品通過采血針進入到超濾管中，采集完成后，輕輕震蕩超濾管，使管壁及中空纖維外壁上的抗凝劑溶解至全血中，得到抗凝血樣；然后，在25 ℃下，離心

7、轉(zhuǎn)速為3500 r/min，離心20 min，從中空纖維內(nèi)腔約取出50μL超濾液，衍生后取20μL衍生液注入色譜系統(tǒng)進行分析。色譜條件：采用Phenomenex C18柱（4.6 mm×250 mm，5μm）；阿德福韋和替諾福韋的流動相分別為10 mM磷酸二氫鉀（內(nèi)含2 mM氫氧化四丁銨）-乙腈（88:12, v/v）和10 mM磷酸二氫鉀（內(nèi)含2 mM氫氧化四丁銨）-乙腈（90:10, v/v）；流速為1.0 mL/min；柱溫為30

8、 ℃；阿德福韋的激發(fā)波長為309 nm，發(fā)射波長為425 nm，替諾福韋的激發(fā)波長為254 nm，發(fā)射波長為425 nm.
　　結(jié)果：測定結(jié)果顯示 FE-HFCF-UF方法具有良好的精密度、靈敏度和回收率。日間和日內(nèi)精密度的RSD值均小于4.1％，絕對回收率可達100%。
　　結(jié)論：該方法操作簡便，集血樣采集與樣品前處理于一體，僅需一步簡單離心，即可從全血中分離得到只含有小分子的超濾液，幾乎免除了人工操作，并且可以使用標準溶

9、液代替加標血樣去制備標準曲線，免除了血漿狀態(tài)對結(jié)果的影響，保證了分析過程的簡便性、準確性和靈敏度。此外，簡便的操作及封閉系統(tǒng)都提高了分析過程的安全性。由于新方法的種種優(yōu)良特性，有望為生物樣品分析提供了一個簡便、有效的分析平臺，并為進一步提高分析方法的生物安全提供了一個新的思路。
　　第二部分：氨茶堿蛋白結(jié)合率的測定以及其與藥物藥效學關(guān)系的研究
　　目的：以中空纖維超濾（HFCF-UF）為基礎(chǔ)方法，測定臨床患者中氨茶堿（AYP

10、）的蛋白結(jié)合率（PPB），并結(jié)合臨床患者信息探討氨茶堿（AYP） PPB的影響因素，為合理化用藥提供參考依據(jù)。
　　方法：采用HFCF-UF方法，測定氨茶堿的游離濃度（Cf），再通過加入釋放劑的方法，使與蛋白相結(jié)合的氨茶堿游離出來，再次使用HFCF-UF法，測定氨茶堿總濃度（Ct），通過公式計算，得出氨茶堿 PPB。色譜條件：采用Diamonsil C18色譜柱（150 mm×4.6 mm，5μm），流動相為10 mmol/L乙酸

11、銨緩沖溶液與甲醇以80:20的比例混合，流速1.0 mL/min，檢測波長為275 nm，進樣量為20μL。
　　結(jié)果：本研究對來自于80位患者的80份臨床樣本進行了PPB測定，結(jié)果顯示PPB范圍為9.8%-98.1%。經(jīng)過數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，患者的性別、生理狀況、疾病狀態(tài)、合并用藥情況對AYP的PPB有影響作用。
　　結(jié)論：患者群體中的氨茶堿 PPB存在著極大的個體間差異，因此，有必要對使用AYP的臨床患者進行PPB監(jiān)測，完善A