新生實(shí)驗(yàn)小型豬肝細(xì)胞用于生物人工肝的基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、肝細(xì)胞是生物人工肝(Bioartificialliver，BAL)的核心材料，BAL對(duì)肝功能衰竭患者的肝支持作用幾乎完全依賴于所用肝細(xì)胞的生物學(xué)功能。由于人肝細(xì)胞來源的匱乏、胎肝細(xì)胞的倫理問題、肝細(xì)胞株的瘤源性等原因，使豬肝細(xì)胞成為BAL研究和應(yīng)用最多的細(xì)胞，成功的臨床報(bào)道愈來愈多，并已進(jìn)入Ⅱ/Ⅲ期臨床研究。但有關(guān)BAL系統(tǒng)中肝細(xì)胞材料、物質(zhì)交換以及肝細(xì)胞的保存和運(yùn)輸?shù)确矫嬉廊淮嬖谥T多尚未徹底解決的問題。 本實(shí)驗(yàn)觀察原代培養(yǎng)乳豬

2、肝細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖特性，檢測(cè)乳豬肝細(xì)胞的合成功能和生物轉(zhuǎn)化功能，以評(píng)價(jià)乳豬肝細(xì)胞是否適用于BAL；使用體外循環(huán)細(xì)胞懸液的方法，觀察循環(huán)狀態(tài)下乳豬肝細(xì)胞形態(tài)和功能的變化，為解決物質(zhì)交換而構(gòu)建雙向循環(huán)系統(tǒng)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)；采用亞低溫培養(yǎng)乳豬肝細(xì)胞，觀察復(fù)溫前后肝細(xì)胞形態(tài)和功能的變化，評(píng)價(jià)亞低溫和亞低溫培養(yǎng)時(shí)間對(duì)肝細(xì)胞的影響，為BAL探索一種方便有效的肝細(xì)胞保存和運(yùn)輸方法。 實(shí)驗(yàn)方法和結(jié)果如下：1.采用RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)乳豬肝

3、細(xì)胞，觀察肝細(xì)胞形態(tài)和數(shù)量的變化，檢測(cè)乳豬肝細(xì)胞白蛋白合成、尿素合成、氯化銨清除、7-甲氧基-試鹵靈和P-硝基苯酚轉(zhuǎn)化情況，并與胎肝細(xì)胞進(jìn)行對(duì)比分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)體外培養(yǎng)的乳豬肝細(xì)胞可增殖7倍以上，其生長(zhǎng)曲線有明顯的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期和停滯期，未見明顯的潛伏期。培養(yǎng)過程中，乳豬肝細(xì)胞尿素合成率、氨清除率、細(xì)胞色素P450系統(tǒng)(CytchromeP450，CYP)活性顯著高于胎肝細(xì)胞，以及較高的尿苷二磷酸葡萄醛酸基轉(zhuǎn)移酶(UDP-glucuronyl

4、transgerases，UGT)活性，提示乳豬肝細(xì)胞具有較強(qiáng)的增殖能力和較好的合成功能、生物轉(zhuǎn)化功能。 2.利用Cello培養(yǎng)循環(huán)式人工毛細(xì)管培養(yǎng)裝置構(gòu)建肝細(xì)胞循環(huán)系統(tǒng)，以50ml/min的流速循環(huán)乳豬肝細(xì)胞懸液，分別觀察循環(huán)狀態(tài)下肝細(xì)胞形態(tài)、活力、功能等的變化。結(jié)果顯示：循環(huán)4h后，乳豬肝細(xì)胞的活力和貼壁率下降，分別為76.1±1.4％、62.8±1.8％，氨清除率是對(duì)照組的62.7±14.6％，提示循環(huán)4h后肝細(xì)胞仍具有一

5、定的活力和功能。繼續(xù)觀察發(fā)現(xiàn)，隨著循環(huán)時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞碎片增多，LDH和AST顯著升高，細(xì)胞活力、貼壁率、白蛋白和尿素合成率、氨清除率顯著下降，表明長(zhǎng)時(shí)間循環(huán)對(duì)肝細(xì)胞有較大的損傷。 3.將新分離的乳豬肝細(xì)胞37℃培養(yǎng)4h后，分別轉(zhuǎn)入25℃、28℃、33℃等溫度下培養(yǎng)24h，再恢復(fù)37℃培養(yǎng)，觀察復(fù)溫前后肝細(xì)胞形態(tài)、生長(zhǎng)特性、活力和功能的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，亞低溫培養(yǎng)24h，乳豬肝細(xì)胞未見明顯增殖，細(xì)胞活力、功能均有不同程度的降低。但

6、復(fù)溫后肝細(xì)胞迅速增殖，細(xì)胞活力和功能較復(fù)溫前顯著升高，其中28℃和33℃培養(yǎng)肝細(xì)胞復(fù)溫后的活力和功能顯著高于25℃培養(yǎng)肝細(xì)胞的活力和功能。進(jìn)一步將肝細(xì)胞置28℃分別培養(yǎng)24h、48h、72h，復(fù)溫后的肝細(xì)胞形態(tài)和功能無顯著差異。上述結(jié)果提示亞低溫抑制肝細(xì)胞的增殖和功能，復(fù)溫后肝細(xì)胞能恢復(fù)細(xì)胞的增殖能力和功能，肝細(xì)胞在28℃亞低溫下能夠較穩(wěn)定地保存72h,可以解決肝細(xì)胞從實(shí)驗(yàn)室或生產(chǎn)單位運(yùn)輸?shù)脚R床應(yīng)用的時(shí)間問題。 以上結(jié)果表明：1