組織化培養(yǎng)肝細(xì)胞用于生物人工肝反應(yīng)器研究.pdf

1、生物人工肝是目前人工肝支持系統(tǒng)的主要研究方向。研究基于中空纖維反應(yīng)器的生物人工肝,并探索新型的肝細(xì)胞培養(yǎng)方式可以促進(jìn)生物人工肝反應(yīng)器的技術(shù)更新。本論文研究了中空纖維內(nèi)腔膠原凝膠包埋分散肝細(xì)胞這一培養(yǎng)方式的傳質(zhì)特性,提出了一種新型的肝細(xì)胞聚球體培養(yǎng)方式,并在此基礎(chǔ)上,結(jié)合中空纖維反應(yīng)器技術(shù)建立了一個(gè)中空纖維內(nèi)腔包埋大鼠肝細(xì)胞聚球體的小型生物人工肝反應(yīng)器。論文主要包括以下三個(gè)部分:
　　1、中空纖維內(nèi)腔凝膠包埋分散肝細(xì)胞培養(yǎng)及其傳質(zhì)能

2、力研究
　　首先,我們用雙室擴(kuò)散結(jié)合時(shí)間延遲法測(cè)定了膠原凝膠的有效擴(kuò)散系數(shù),證明了膠原內(nèi)的擴(kuò)散阻力會(huì)隨著細(xì)胞包埋數(shù)量而快速增大。實(shí)驗(yàn)又發(fā)現(xiàn)包埋原代肝細(xì)胞以及連續(xù)細(xì)胞株KB細(xì)胞的膠原凝膠都會(huì)發(fā)生不同程度地收縮,并且這種收縮會(huì)大大降低葡萄糖在膠原中的有效擴(kuò)散系數(shù)。通過靜置培養(yǎng)中空纖維內(nèi)腔凝膠包埋的肝細(xì)胞和KB細(xì)胞,并測(cè)定細(xì)胞活率以及肝細(xì)胞的尿素合成能力,我們進(jìn)一步確認(rèn)了該系統(tǒng)的擴(kuò)散阻力對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)的影響。用截留分子量30 kDa的超濾膜

3、包埋的兩種細(xì)胞都不能存活。使用孔徑0.1 gm的微濾膜包埋的肝細(xì)胞比用截留分子量100 kDa的超濾膜包埋的肝細(xì)胞的尿素合成能力高50％以上。
　　2、肝細(xì)胞的聚球體培養(yǎng)
　　我們發(fā)現(xiàn)在肝細(xì)胞懸液中加入少量的Ⅰ型膠原后,注入中空纖維內(nèi)腔培養(yǎng),細(xì)胞在48小時(shí)內(nèi)就會(huì)自發(fā)形成聚球體。根據(jù)所加膠原量的不同,一般形成球狀或者柱狀的聚球體,聚球體的形成率在50%左右。掃描電鏡顯示聚球體表面有大量的微絨毛和一些小孔。透射電鏡顯示了聚球體內(nèi)

4、的細(xì)胞之間形成了連續(xù)的類膽管結(jié)構(gòu),并延伸到聚球體表面形成開孔。對(duì)聚球體內(nèi)肝細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)觀察說明了聚球體內(nèi)的肝細(xì)胞與體內(nèi)細(xì)胞形態(tài)比較接近,聚球體是一種高度組織化的培養(yǎng)方式。并且靜置培養(yǎng)的結(jié)果說明,球狀和柱狀聚球體的尿素合成和白蛋白分泌能力均高于凝膠包埋的分散肝細(xì)胞。
　　3、小型生物人工肝反應(yīng)器的構(gòu)建與研究
　　基于柱狀聚球體的形成技術(shù),我們建立了一個(gè)小型的生物人工肝反應(yīng)器。反應(yīng)器的細(xì)胞活率以及肝功能至少維持了5天,尿素合成