基于微囊懸浮流化床式反應(yīng)器的肝細(xì)胞培養(yǎng)模式的研究.pdf

1、背景
　　 肝衰竭是國際性的治療難題。人工肝尤其是以培養(yǎng)肝細(xì)胞為基礎(chǔ)的生物人工肝的不斷發(fā)展與成熟為肝衰竭的治療開辟了新的途徑。到目前為止，國內(nèi)外已有數(shù)個生物人工肝系統(tǒng)進(jìn)入到Ⅰ-Ⅲ期臨床試驗，但將其應(yīng)用到臨床并推廣使用，還存在諸多問題有待解決。其中首要問題是如何獲得足夠數(shù)量、高活性并且功能良好的肝細(xì)胞。因此，生物人工肝對肝細(xì)胞培養(yǎng)的規(guī)模和質(zhì)量提出了更高的要求。
　　 目前已有多種培養(yǎng)技術(shù)被應(yīng)用到生物人工肝的研究中，如微囊化

2、培養(yǎng)、微載體培養(yǎng)、反應(yīng)器培養(yǎng)，流化培養(yǎng)及共培養(yǎng)等技術(shù)。為了揚長避短，多種培養(yǎng)方式結(jié)合可能更有利于維持或提高肝細(xì)胞的功能和活性，本實驗室前期已成功構(gòu)建了基于微囊懸浮型流化床式反應(yīng)器的新型生物人工肝系統(tǒng)，體外及動物實驗的初步結(jié)果是我們相信微囊懸浮流化床式反應(yīng)器能夠為肝細(xì)胞大規(guī)模、高活性培養(yǎng)提供可靠的技術(shù)支持。
　　 目的
　　 本課題根據(jù)新型生物人工肝系統(tǒng)對肝細(xì)胞培養(yǎng)的要求，采用微囊化培養(yǎng)、共培養(yǎng)及流化培養(yǎng)技術(shù)相結(jié)合，旨在為

3、新型生物人工肝提供足量高活性、功能良好的肝細(xì)胞。
　　 方法
　　 1.確定制備微囊的穩(wěn)定條件，全面評價微囊的機械強度、物質(zhì)通透性以及微囊內(nèi)細(xì)胞的活性，為下一步的研究打下基礎(chǔ)。
　　 2.構(gòu)建基于微囊流化床式反應(yīng)器的培養(yǎng)系統(tǒng)，以單層貼壁培養(yǎng)(2D)為對照，采用微囊靜態(tài)培養(yǎng)(3D)、微囊共培養(yǎng)(3D-Co)、微囊流化培養(yǎng)(3D-F)、微囊流化共培養(yǎng)(3D-F-Co)等四種培養(yǎng)模式培養(yǎng)肝細(xì)胞，評價在不同模式下肝細(xì)胞的

4、合成能力和藥物代謝能力。
　　 3.采用蛋白質(zhì)芯片、Realtime-PCR、Western Blot等技術(shù)初步研究肝細(xì)胞功能改變的機制。
　　 結(jié)果
　　 1.確定了兩種不同直徑(800μm，300μm)微囊的穩(wěn)定制備條件，制備的微囊具有良好的機械強度和物質(zhì)通透性，微囊化的肝細(xì)胞在培養(yǎng)過程中保持很高的活性。
　　 2.不同培養(yǎng)模式下肝細(xì)胞功能評價結(jié)果顯示：微囊化培養(yǎng)相比單層貼壁培養(yǎng)優(yōu)勢明顯；微囊共培養(yǎng)能

5、夠顯著提高肝細(xì)胞的白蛋白合成能力和CYP1A2的活性；微囊流化培養(yǎng)能夠顯著提高肝細(xì)胞的合成能力和CYP1A2的活性；流化共培養(yǎng)在提高肝細(xì)胞的CYP3A4、CYP1A2的活性方面效果最顯著。
　　 3.HepLi3細(xì)胞功能與肝腫瘤細(xì)胞系相近，微囊流化培養(yǎng)系統(tǒng)能夠顯著提高其合成功能和CYP3A4、CYP1A2的活性。
　　 4.蛋白芯片分析顯示hPMSC細(xì)胞能夠分泌多種細(xì)胞因子參與調(diào)節(jié)肝細(xì)胞的增殖、凋亡和功能的發(fā)揮；Real

6、time-PCR結(jié)果顯示微囊化培養(yǎng)和共培養(yǎng)可顯著提高肝細(xì)胞功能相關(guān)基因的表達(dá)水平；WesternBlot結(jié)果顯示肝細(xì)胞CYP2E1、CYP1A2的蛋白表達(dá)量增高，微囊流化共培養(yǎng)能夠顯著下調(diào)肝細(xì)胞內(nèi)PKC，ERK及PKA的磷酸化水平及鈣調(diào)蛋白的表達(dá)水平。
　　 結(jié)論
　　 1.基于微囊懸浮型流化床式反應(yīng)器的培養(yǎng)系統(tǒng)能夠維持并提高肝細(xì)胞活性和功能；微囊流化共培養(yǎng)為最佳的肝細(xì)胞培養(yǎng)模式。
　　 2.肝細(xì)胞功能的提高可能