微囊漏斗形流化床式生物反應(yīng)器創(chuàng)建及體外初步評價研究.pdf

1、重型肝炎病情危重，預(yù)后兇險，其治療是臨床上一大難題。生物型人工肝(bioartificialliver，BAL)理論上講可以代償肝臟的全部功能，構(gòu)建BAL已經(jīng)成為人工肝研究領(lǐng)域治療重型肝炎的熱點。生物反應(yīng)器是生物人工肝的核心裝置。目前應(yīng)用最多的是中空纖維生物反應(yīng)器，但是難以放大且半透膜致使物質(zhì)彌散障礙等都限制了其應(yīng)用。微囊肝細(xì)胞培養(yǎng)的流化床反應(yīng)器是必然的選擇。 BAL欲得到臨床應(yīng)用，必須容易“放大”，約需1010數(shù)量級的肝細(xì)胞數(shù)

2、。傳統(tǒng)體外培養(yǎng)方法難以達(dá)到，另外還必須解決免疫排斥問題。生物微膠囊具有選擇性物質(zhì)通透性，允許營養(yǎng)成分及小分子物質(zhì)自由通過，并且有免疫隔離效果。目前微囊技術(shù)已廣泛用于生物人工肝研究。 目前轉(zhuǎn)瓶大規(guī)模微囊肝細(xì)胞培養(yǎng)國內(nèi)外均未見報道，而適合微囊肝細(xì)胞的反應(yīng)器為流化床式生物反應(yīng)器，流化床的流化作用能使體外循環(huán)液充分接觸微囊化肝細(xì)胞進(jìn)行物質(zhì)交換和物質(zhì)代謝。傳統(tǒng)的固化床液體流動時具有剪切力大，物質(zhì)交換效率低，易于形成無效腔和死腔等缺點。并且

3、其結(jié)構(gòu)多為圓柱體狀，液體流化時的不均一性，存在邊際效應(yīng)，導(dǎo)致無效腔形成。我們設(shè)計并研制了一種基于改善流化床反應(yīng)器徑向傳遞性能及混合效果和便于規(guī)?；瘧?yīng)用的一套漏斗形新型結(jié)構(gòu)流化床反應(yīng)器。 本研究旨在建立微囊永生化肝細(xì)胞大規(guī)模高活性培養(yǎng)體系；構(gòu)建新型漏斗形流化床式反應(yīng)器及對其結(jié)構(gòu)參數(shù)的研究：使用體外培養(yǎng)基循環(huán)以及重型肝炎血漿模型對此構(gòu)建的生物反應(yīng)器進(jìn)行體外評價，為今后進(jìn)一步實驗提供理論基礎(chǔ)。 第一部分微囊化永生化肝細(xì)胞的大規(guī)

4、模轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)及評價 目的：本研究旨在建立一種大規(guī)模海藻酸/殼聚糖(AC)微囊化肝細(xì)胞的轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)體系，并對大規(guī)模微囊化肝細(xì)胞進(jìn)行功能評價研究。 方法：AC微囊的表征測定(機械強度、物質(zhì)滲透性免疫隔離作用)、一步法大規(guī)模包裹制備微囊永生化肝細(xì)胞，微囊肝細(xì)胞與裸細(xì)胞轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)20天，動態(tài)評價微囊肝細(xì)胞增殖能力及物質(zhì)代謝功能。 結(jié)果：AC微囊能承受高速振蕩剪切力的作用而保持形態(tài)完整；不僅能對小分子物質(zhì)如白蛋白自由通過，而且阻

5、止免疫球蛋白的釋放。與裸細(xì)胞培養(yǎng)比較，大規(guī)模轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)AC微囊肝細(xì)胞能改善細(xì)胞的生長代謝及功能(白蛋白合成、氨代謝以及利多卡因清除能力)。 結(jié)論：建立了一種大規(guī)模AC微囊化肝細(xì)胞的轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)體系；一步法大規(guī)模制作的AC微囊性能可靠；轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)微囊化肝細(xì)胞功能在2周左右達(dá)到最佳狀態(tài)，此培養(yǎng)模式的建立有應(yīng)用生物人工肝支持系統(tǒng)的廣闊前景。 第二部分新型漏斗形流化床式反應(yīng)器初步研制及結(jié)構(gòu)參數(shù)研究 目的：本研究旨在設(shè)計一種符合流

6、體力學(xué)的漏斗形生物反應(yīng)器，通過微囊置于反應(yīng)器中在模擬體外循外灌流狀態(tài)下摸索反應(yīng)器的適宜流化參數(shù)。 材料與方法：自行設(shè)計一定高度和錐度的漏斗形流化床式生物反應(yīng)器，計算反應(yīng)器結(jié)構(gòu)參數(shù)；觀測微囊在流化床流化狀態(tài)的變化情況。排液體積法測定循環(huán)液氣含率，測定流化床表觀速率、最佳流化高度、觀察微囊流化8小時后的完整性。 結(jié)果：自行設(shè)計的漏斗形反應(yīng)器容積約550ml，高度25cm，錐度92達(dá)到最佳流化狀態(tài)大致分四個過程：固化床、起始流

7、化床、循環(huán)床、完全循環(huán)流化床。流化床的氣含率隨著微囊的固含率增加，氣含率隨之增加，300g/L微囊固含率時氣含率達(dá)到最大，而后固化率增加氣含率緩慢下降。最佳流化高度為23cm時，泵速為85ml/min，微囊的流化速率為1.19cm/s。流化8小時，微囊完整性在97％以上。 結(jié)論：流化床式反應(yīng)器作為承載微囊化人工肝適宜的生物反應(yīng)器，流化床的流化參數(shù)直接影響到流化效果，對這些參數(shù)的探索對今后微囊流化床生物反應(yīng)器的應(yīng)用于生物人工肝研究

8、具有指導(dǎo)意義。 第三部分新型微囊漏斗形流化床式反應(yīng)器體外初步評價 目的：應(yīng)用培養(yǎng)基循環(huán)驗證流化床反應(yīng)器流化作用對肝細(xì)胞功能代謝的影響；應(yīng)用廢棄重型肝炎血漿模型對新構(gòu)建的生物反應(yīng)器進(jìn)行評價，觀察流化床微囊化肝細(xì)胞對重肝血漿的代謝作用以及二者的相互影響。為下一步動物實驗奠定基礎(chǔ)。 材料與方法：正確建立體外循環(huán)，將培養(yǎng)2周的微囊化肝細(xì)胞分為兩組(培養(yǎng)基體外培養(yǎng)組和流化床組)，實驗組微囊肝細(xì)胞置于流化床式生物反應(yīng)器中，D

9、MEM高糖完全培養(yǎng)基1000ml體外循環(huán)12小時，動態(tài)檢測上清中的ALT、LDH以及白蛋白的水平；重型肝炎血漿置換術(shù)后的被置換血漿，作為微囊生物人工肝治療的血漿模型。將總量約5×109活率在90％以上的微囊肝細(xì)胞置于流化床反應(yīng)器，稀釋50％的血漿體外循環(huán)6小時，實驗前后測定血漿中ALT、TBi、DBi、ALB變化以及微囊肝細(xì)胞的活性以及電鏡觀察肝細(xì)胞的微觀結(jié)構(gòu)變化情況。 結(jié)果：體外培養(yǎng)基循環(huán)12小時的評價中ALT、LDH水平均有

10、上升，靜止培養(yǎng)組ALT上升更為明顯，兩組相比有顯著性差異(H4，p＜0.01；H6，p＜0.05；H12，p＜0.01)．兩組白蛋白的合成均有不同程度增多，流化床組升高更為明顯(H6，p＜0.01；H12，p＜0.05)，與此同時，靜止培養(yǎng)組和流化床組從6小時后白蛋白合成量較前比較明顯增多，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.05或者p＜0.01)。微囊流化床組實驗前肝細(xì)胞活率平均為93.5±3.2％，循環(huán)12小時后肝細(xì)胞活率為90.6±6.5％

11、(P＞0.05)。而培養(yǎng)基靜止培養(yǎng)組實驗前肝細(xì)胞活率平均為93.9±4.4％，實驗結(jié)束后微囊肝細(xì)胞活率略有下降，平均為87.8±3.8％，但沒有統(tǒng)計學(xué)意義。 廢棄血漿體外循環(huán)功能評價顯示：微囊流化床流化6小時后ALT水平無明顯上升，靜止培養(yǎng)組ALT有明顯的升高，兩組相比有顯著性差異(H6，p＜0.05)，而靜止培養(yǎng)組中ALT水平較實驗前有明顯上升(p＜0.05)。體外靜止培養(yǎng)組治療前后總膽紅素及直接膽紅素?zé)o明顯下降；而漏斗形流化

12、床組則6小時體外循環(huán)后相比靜止培養(yǎng)組有明顯的下降(p＜0.05)。此外，漏斗形流化床組在治療前后膽紅素也有一定程度下降(p＜0.05)，具有統(tǒng)計學(xué)意義。兩組中白蛋白無明顯變化。微囊流化床組循環(huán)6小時后肝細(xì)胞活率有明顯下降(p＜0.05)；靜止培養(yǎng)組實驗結(jié)束后微囊肝細(xì)胞活率明顯下降，有顯著性差異(p＜0.01)。兩組在實驗結(jié)束后活率比較，靜止培養(yǎng)組肝細(xì)胞活率下降明顯，具有顯著性差異(p＜0.05)。廢棄血漿靜止培養(yǎng)的微囊化肝細(xì)胞實驗結(jié)束后