纖維支架循環(huán)灌注式生物反應(yīng)器規(guī)?；囵B(yǎng)肝細(xì)胞的初步探討.pdf

1、急性肝衰竭(acute liver failure，ALF)是指無(wú)基礎(chǔ)肝臟疾病患者，在肝臟受到各種創(chuàng)傷后（物理、化學(xué)、生物性等），發(fā)生的肝功能損害或衰竭的急癥，其發(fā)病急，病程進(jìn)展迅速，未加治療自然病程死亡率高達(dá)80％。目前尚無(wú)特效治療方法，內(nèi)科保守治療，患者死亡率仍高達(dá)50％以上，臨床最有效的治療方法是肝移植，但由于供肝的短缺，限制了肝移植的廣泛應(yīng)用。大部分急性肝衰竭的患者未能等到可移植肝源就已死亡，因此急切需要一種暫時(shí)可以替代肝臟功能

2、的機(jī)器，給予急性肝功能衰竭患者充足的時(shí)間過(guò)渡到肝移植狀態(tài)或肝細(xì)胞再生狀態(tài)，人工肝是治療肝衰竭患者的有效途徑，可在短時(shí)間內(nèi)達(dá)到部分或全部替代肝臟功能的目的，為急性肝衰竭患者贏得寶貴時(shí)間。
　　近十年來(lái)，人工肝研究取得了長(zhǎng)足進(jìn)展，從早期簡(jiǎn)單的機(jī)械型人工肝進(jìn)步至生物型人工肝，再到更為合理的混合型（機(jī)械+生物型）生物人工肝。生物反應(yīng)器作為生物人工肝的核心部分，主要包括：中空纖維型，結(jié)合微載體培養(yǎng)型，細(xì)胞球懸浮培養(yǎng)型等多種，但對(duì)于臨床治療所

3、要求的1010數(shù)量級(jí)細(xì)胞量，極少有生物反應(yīng)器能達(dá)到上述要求。
　　本課題組經(jīng)過(guò)多年的努力，研發(fā)了基于NASA微重力培養(yǎng)反應(yīng)器的微載體貼附懸浮式生物生物反應(yīng)器的人工肝支持系統(tǒng)原理機(jī)和商品化機(jī)器，并在大動(dòng)物（西藏小型豬及食蟹猴）上進(jìn)行驗(yàn)證。為了進(jìn)一步向臨床需求靠攏，在以上的基礎(chǔ)上研制纖維支架循環(huán)灌注式生物反應(yīng)器，以期達(dá)到臨床治療要求數(shù)量級(jí)的肝細(xì)胞，并在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中嘗試對(duì)108細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，擴(kuò)增至109-1010的肝細(xì)胞進(jìn)行長(zhǎng)達(dá)15d的培

4、養(yǎng)，并初步取得成功，其主要由纖維支架反應(yīng)罐，外置灌流系統(tǒng)，氧氣檢測(cè)系統(tǒng)，二氧化碳檢測(cè)系統(tǒng)，溫度控制系統(tǒng)，懸浮攪拌系統(tǒng)等構(gòu)成;其具有獨(dú)特的特點(diǎn)：①.逆重力式灌流，降低流體剪切力;②.外置循環(huán)灌注培養(yǎng)模式，增加液體交換效率;③.全自動(dòng)氧氣、二氧化碳、酸堿度檢測(cè)調(diào)整系統(tǒng);④.體型變小，重量變輕，易于運(yùn)輸。
　　第一章 纖維支架載體肝細(xì)胞生物相容性評(píng)價(jià).
　　目的：
　　對(duì)纖維支架材料的構(gòu)成，理化性質(zhì)加以分析，完成對(duì)纖維支架循

5、環(huán)灌注式生物反應(yīng)器的設(shè)計(jì)及組裝，檢測(cè)纖維支架材料與肝細(xì)胞之間的生物相容性。
　　方法：
　　采用電鏡，X射線光電子能譜分析(X-ray photoelectron spectroscopy，XPS)等技術(shù)分析纖維支架材料特征，元素構(gòu)成，表面電荷及氨基酸分析纖維支架材料表面粘附氨基酸分子;通過(guò)高溫高壓(121℃，45min)，強(qiáng)酸(10％鹽酸，浸泡24h)強(qiáng)堿(10％碳酸氫鈉，浸泡24h)處理后通過(guò)電鏡觀察其表面性質(zhì)及破損情況

6、分析其穩(wěn)定性。在纖維支架載體上接種C3A細(xì)胞，并隨后采用Live/dead試劑盒細(xì)胞生長(zhǎng)狀況進(jìn)行評(píng)價(jià)。
　　結(jié)果：
　　纖維支架載體，此載體長(zhǎng)10cm，寬1.13cm，為細(xì)胞提供接近11.3cm2貼附面積，電鏡下觀察纖維直徑均一，多層交叉，形成多種空隙，面積體積比大，可以提供較大細(xì)胞生長(zhǎng)表面積。此支架主要成分為C，N，O分別74.32％，2.84％，22.84％，密度為ρ=0.2254mmol/g。支架表面攜帶賴氨酸，攜帶正

7、電荷，增強(qiáng)細(xì)胞粘附。在高溫，高壓，強(qiáng)酸，強(qiáng)堿處理后，纖維支架材料均呈現(xiàn)出穩(wěn)定狀態(tài)，電鏡下未觀察到纖維破裂、變形、融化等不良現(xiàn)象。細(xì)胞對(duì)纖維支架載體貼附良好，5d內(nèi)細(xì)胞活力維持大于90％，與對(duì)照組比較無(wú)顯著差異(P＞0.05)。
　　結(jié)論：
　　纖維支架材料面積體積比大，高溫高壓強(qiáng)酸強(qiáng)堿處理后理化性質(zhì)穩(wěn)定，細(xì)胞帖附緊密生長(zhǎng)旺盛，肝細(xì)胞與支架細(xì)胞相容性良好。
　　第二章 纖維支架循環(huán)灌注式生物反應(yīng)器大規(guī)模培養(yǎng)肝細(xì)胞.

8、>　　目的:
　　使用纖維支架循環(huán)灌注式生物反應(yīng)器大規(guī)模培養(yǎng)肝細(xì)胞，達(dá)到1010臨床治療要求水平，為新型生物人工肝系統(tǒng)提供可靠的生物反應(yīng)器部件。
　　方法:
　　按照說(shuō)明調(diào)試機(jī)器，校準(zhǔn)PH、溫度溶氧探頭，并提前預(yù)濕載體(600-700ml全培，37℃，2cm/s空轉(zhuǎn)24h;將108的C3A細(xì)胞量，并消化離心成50ml懸濁液，接種入反器，4H后取樣檢測(cè)細(xì)胞懸浮情況，隨后每日取樣進(jìn)行臺(tái)盼藍(lán)染色、結(jié)晶紫染色、細(xì)胞計(jì)數(shù)，Q-P

9、CR、電鏡觀察;每日取培養(yǎng)基上清送檢葡萄糖、白蛋白、ALT、AST、乳酸。
　　結(jié)果:
　　細(xì)胞生長(zhǎng)良好，在15d的培養(yǎng)中，細(xì)胞從1.07×108增長(zhǎng)至約90-100×108個(gè)，結(jié)晶紫染色，染色面積逐漸增加，至15d載體面積貼附約為70％-80％，細(xì)胞活力維持在75％以上，ALT、AST漏出水平低，細(xì)胞損傷小，細(xì)胞基因表達(dá)水平較平板對(duì)照組顯著增高，電鏡觀察發(fā)現(xiàn)細(xì)胞-細(xì)胞間連接增多。
　　結(jié)論:
　　纖維支架循環(huán)灌