旋轉(zhuǎn)式生物反應(yīng)器內(nèi)微載體培養(yǎng)擴增皮膚相關(guān)細(xì)胞及微粒皮膚的初步制備.pdf

1、隨著細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展，對皮膚相關(guān)細(xì)胞的培養(yǎng)，特別是人表皮細(xì)胞的培養(yǎng)有了很大的進(jìn)展。在適宜的培養(yǎng)條件下，單個細(xì)胞在培養(yǎng)中不斷增殖，逐漸融合成片狀，形成了類似皮膚表皮層的上皮組織。這使得在較短的時間里，用大量表皮細(xì)胞培育成小片狀的上皮組織成為可能。臨床工作中，外科醫(yī)生和細(xì)胞生物學(xué)家們也大量培養(yǎng)自體表皮細(xì)胞并用來修復(fù)皮膚缺損的病人。表皮細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)也從使用含血清培養(yǎng)液和細(xì)胞滋養(yǎng)層的培養(yǎng)方式,到不含血清、無滋養(yǎng)層的培養(yǎng)方式。培養(yǎng)方法的發(fā)展也促

2、進(jìn)了臨床應(yīng)用,從最初的細(xì)胞懸液移植到自體異體細(xì)胞膜片移植,以及表皮細(xì)胞生物材料復(fù)合物移植。培養(yǎng)和移植方法的發(fā)展使人們在治療大面積皮膚缺損方面看到了希望。
　　細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)對研究動物細(xì)胞的結(jié)構(gòu)、功能和分化過程中的作用非常重要。因此，將微載體培養(yǎng)技術(shù)應(yīng)用到貼壁依賴型細(xì)胞的大量培養(yǎng)，使上述研究進(jìn)入到了一個新的層次。在微載體培養(yǎng)環(huán)境中，通過在培養(yǎng)液中輕柔的轉(zhuǎn)動或者攪拌，細(xì)胞在微球表面呈現(xiàn)單層或者復(fù)層生長，在這種無復(fù)雜結(jié)構(gòu)的懸浮培養(yǎng)體系中，

3、可獲得2x108個/毫升的細(xì)胞量。
　　Cytodex微載體是GEHealthcare公司為大量培養(yǎng)各類動物細(xì)胞專門開發(fā)的微載體，其培養(yǎng)體系的容器可以從數(shù)毫升到數(shù)千升，非常適合大規(guī)模擴增細(xì)胞。這種微載體的表面對細(xì)胞生長過程中的貼附和伸展過程專門優(yōu)化，它的直徑和密度也非常適合懸浮狀態(tài)大規(guī)模培養(yǎng)擴增各類細(xì)胞。構(gòu)成微載體球體的基質(zhì)材料生物穩(wěn)定性很好，提供給細(xì)胞適宜的表面生長環(huán)境。透光的球體也很容易通過顯微鏡觀察貼附之上的細(xì)胞。通過以往的

4、廣泛使用可以看出，cytodex十分適合作為微載體培養(yǎng)細(xì)胞。
　　旋轉(zhuǎn)式生物反應(yīng)器是由一個水平軸旋轉(zhuǎn)的培養(yǎng)容器和與其共軸的氧合器組成，當(dāng)容器以水平軸開始旋轉(zhuǎn)時，充滿其中的培養(yǎng)液作為一個整體也發(fā)生旋轉(zhuǎn)，這種方式使內(nèi)容物受到極小的剪切力。培養(yǎng)體系中的細(xì)胞旋轉(zhuǎn)時所受的離心力、重力和科氏力抵消，因此細(xì)胞能大體維持懸浮狀態(tài)。培養(yǎng)體系中的細(xì)胞受到極小的機械力的同時獲得大量的氧、營養(yǎng)物質(zhì)的供應(yīng)。細(xì)胞所需的氣體通過硅橡膠膜微量而持續(xù)的交換，避免了

5、旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)體系中出現(xiàn)大的氣泡和渦流。
　　在臨床工作中，使用自體表皮細(xì)胞，成纖維細(xì)胞快速有效的修復(fù)各類皮膚缺損對皮膚愈合有很大意義，而足夠數(shù)量的種子細(xì)胞對構(gòu)建組織工程皮膚非常重要。本研究嘗試使用Cytodex-3微載體和高截面縱橫比的旋轉(zhuǎn)式生物反應(yīng)器作為培養(yǎng)系統(tǒng)，大規(guī)模擴增人真皮成纖維細(xì)胞和人表皮細(xì)胞，期待能為各類組織工程皮膚產(chǎn)品提供充足的種子細(xì)胞。
　　第一部分：實驗成纖維細(xì)胞和表皮細(xì)胞的體外培養(yǎng)及鑒定
　　1、主要方

6、法：
　　獲取新生兒包皮切除術(shù)后組織，人表皮細(xì)胞使用中性蛋白酶和胰蛋白酶兩步消化法獲取，人真皮成纖維細(xì)胞使用胰酶消化組織塊貼壁法獲取。待原代培養(yǎng)成功后常規(guī)傳代擴增。免疫組化方法進(jìn)行抗波形絲蛋白、抗角蛋白染色，顯微鏡下觀察。
　　2、主要結(jié)果：
　　倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)和生長情況。人表皮細(xì)胞呈圓形，細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)瓶底，密度均勻。人真皮成纖維細(xì)胞呈長梭形，胞核飽滿。免疫組化結(jié)果顯示人真皮成纖維細(xì)胞抗波形絲蛋白染色陽性，人

7、表皮細(xì)胞抗角蛋白染色為陽性。
　　3、主要結(jié)論：
　　通過鑒定，本實驗所獲取以及體外培養(yǎng)擴增的細(xì)胞分別為人真皮成纖維細(xì)胞和人表皮細(xì)胞。
　　第二部分：實驗旋轉(zhuǎn)式生物反應(yīng)器培養(yǎng)擴增人真皮成纖維細(xì)胞
　　1、主要方法：
　　利用組織貼壁法從人皮膚中分離出人真皮成纖維細(xì)胞（hDFBs）進(jìn)行體外培養(yǎng)，使用DIO標(biāo)記細(xì)胞后結(jié)合微載體在旋轉(zhuǎn)式生物反應(yīng)器（RCCS）中培養(yǎng)，細(xì)胞貼附微載體的狀況使用熒光顯微鏡，掃描電鏡觀測

8、。并且檢測細(xì)胞周期和分析細(xì)胞群體倍增時間來比較微重力培養(yǎng)與平面培養(yǎng)的體外增殖能力差異。
　　2、主要結(jié)果：
　　在旋轉(zhuǎn)式生物反應(yīng)器的微重力培養(yǎng)體系中，人成纖維細(xì)胞能快速貼附到微載體表面，在培養(yǎng)過程中達(dá)到很高的細(xì)胞密度，并且表現(xiàn)出很強的增殖能力和細(xì)胞活性。
　　3、主要結(jié)論：
　　利用生物反應(yīng)器和微載體懸浮培養(yǎng)人皮膚成纖維細(xì)胞，是大量制備皮膚組織工程種子細(xì)胞的一種有效方法。
　　第三部分：實驗使用旋轉(zhuǎn)式生物反

9、應(yīng)器體外擴增人表皮細(xì)胞
　　1、主要方法
　　使用Cytodex-3微載體和高截面縱橫比的旋轉(zhuǎn)式生物反應(yīng)器容器作為培養(yǎng)系統(tǒng)大規(guī)模擴增人表皮細(xì)胞(hECs)。用中性蛋白酶和胰蛋白酶-EDTA兩步驟法從人皮膚中分離出人表皮細(xì)胞，使用DIL標(biāo)記細(xì)胞后結(jié)合微載體后在旋轉(zhuǎn)式生物反應(yīng)器（RCCS）中培養(yǎng)，細(xì)胞貼附微載體的生長狀態(tài)使用倒置顯微鏡，掃描電鏡觀測。并且分析細(xì)胞群體倍增時間來比較微重力培養(yǎng)與平面培養(yǎng)的體外增殖能力差異。
　

10、　2、主要結(jié)果
　　在旋轉(zhuǎn)式生物反應(yīng)器的微重力培養(yǎng)體系中，人表皮細(xì)胞能快速貼附到微載體表面，在培養(yǎng)過程中達(dá)到很高的細(xì)胞密度，并且表現(xiàn)出很強的增殖能力和細(xì)胞活性。
　　3、主要結(jié)論
　　使用旋轉(zhuǎn)式生物反應(yīng)器和微載體懸浮培養(yǎng)人表皮細(xì)胞，是大量制備皮膚組織工程種子細(xì)胞的一種有效方法。
　　第四部分：實驗使用旋轉(zhuǎn)式生物反應(yīng)器制備微粒皮膚
　　1、主要方法：
　　人表皮細(xì)胞的體外培養(yǎng)中，培養(yǎng)液中的血清成分有誘導(dǎo)

11、分化作用，會使其過早的進(jìn)入終末狀態(tài)，增殖趨于停止，通常對表皮細(xì)胞的培養(yǎng)早期使用角質(zhì)細(xì)胞無血清培養(yǎng)液（K-SFM）。而在人成纖維細(xì)胞在體外培養(yǎng)過程中，含血清的培養(yǎng)液對其增殖有利?？紤]到兩種細(xì)胞對培養(yǎng)液的不同要求，本實驗分別嘗試兩種不同方法：培養(yǎng)液血清濃度梯度降低法和表皮培養(yǎng)液共培養(yǎng)法，使用Cytodex-3微載體和高截面縱橫比的旋轉(zhuǎn)式生物反應(yīng)器容器作為培養(yǎng)系統(tǒng)嘗試制備微粒皮膚。并使用掃描電鏡觀察細(xì)胞的貼附生長狀態(tài)。
　　2、主要結(jié)果