生物人工肝聚砜膜中空纖維反應器的初步研究.pdf

1、反應器是生物人工肝(Bioartificialliver，BAL)系統(tǒng)的核心部分，其性能直接關(guān)系到人工肝支持的效率和效果。由于同種肝細胞、肝細胞株和肝干細胞分別存在來源困難、安全隱患和研究欠深入等問題，故培養(yǎng)異種肝細胞的中空纖維反應器成為BAL研究的主要方向。聚砜膜具有良好的熱穩(wěn)定性、耐氧化性、機械加工性，但是其對肝細胞的粘附性及對肝細胞功能發(fā)揮的影響尚不清楚。生物反應器膜材料的性能、適合于BAL的細胞培養(yǎng)方式、中空纖維反應器的性能都是

2、BAL研究中需要解決的問題。 本實驗觀察原代乳豬肝細胞在聚砜膜界面生長的形態(tài)，檢測聚砜膜生物界面對乳豬肝細胞的合成功能和生物轉(zhuǎn)化功能的影響，以評價聚砜膜是否為良好的反應器膜材料；應用磁力攪動法進行乳豬肝細胞多細胞聚集體的培養(yǎng)，觀察多細胞聚集體的形態(tài)和功能，探索適合于BAL的細胞培養(yǎng)方式；采用聚砜膜中空纖維反應器構(gòu)建生物反應器實驗系統(tǒng)，觀察乳豬肝細胞多細胞聚集體接種到反應器的生長情況和功能變化及該系統(tǒng)對重型肝炎病人血漿(Sever

3、ehepatitisplasma，SHP)的影響，以評價聚砜膜中空纖維反應器的性能。實驗方法和結(jié)果如下： 一、乳豬肝細胞在聚砜膜生物界面生長的研究 觀察乳豬肝細胞在聚砜膜生物界面的生長情況，檢測其白蛋白合成、尿素合成、氯化銨清除、酶漏出量的情況，并與乳豬肝細胞在聚苯乙烯界面生長的情況進行對比分析。形態(tài)觀察顯示，在聚砜膜界面生長的乳豬肝細胞形態(tài)規(guī)整，大小均一，呈球型粘附、鋪展，形成多細胞聚集體。在培養(yǎng)過程中，聚砜膜上生長的

4、肝細胞白蛋白合成率、尿素合成率和氨清除率均優(yōu)于聚苯乙烯界面生長的乳豬肝細胞，聚砜膜和聚苯乙烯兩組的乳豬肝細胞LDH和AST漏出量在低水平波動，兩組肝細胞的LDH、AST含量無顯著性差異。 二、磁力攪動法培養(yǎng)乳豬肝細胞多細胞聚集體的觀察 將新分離的乳豬肝細胞懸液放入平底燒瓶中，利用磁力攪拌器和攪拌子，進行多細胞聚集體的磁力攪動培養(yǎng)，計算多細胞聚集體的形成率、貼壁率，觀察多細胞聚集體的形態(tài)，檢測多細胞聚集體的白蛋白合成量、尿

5、素合成量、酶漏出量等指標。在培養(yǎng)過程中，多細胞聚集體形成率隨時間的延長而上升，貼壁率隨時間的延長而下降，6h，多細胞聚集體的形成率為73.5±10.5％，貼壁率在78.6±6.9％。多細胞聚集體多為10～20個乳豬肝細胞組成，直徑在100～200μm之間，形態(tài)規(guī)則，輪廓清晰，超微結(jié)構(gòu)基本正常。在整個實驗過程中，多細胞聚集體能保持較好的白蛋白合成率、尿素合成率。本實驗中多細胞聚集體培養(yǎng)液上清的AST和LDH漏出量的水平較高，尤其以前2h為

6、最。 三、聚砜膜中空纖維反應器性能的評價 利用聚砜膜中空纖維反應器和Cello培養(yǎng)循環(huán)式人工毛細管培養(yǎng)裝置構(gòu)建反應器實驗系統(tǒng)，將磁力攪動法培養(yǎng)所得的多細胞聚集體接種到反應器外腔，觀察反應器中培養(yǎng)的多細胞聚集體的白蛋白合成量、尿素合成量、酶漏出量及對SHP的影響。在整個實驗時間里，反應器外腔所留標本測得肝細胞的白蛋白合成率隨時間的延長而升高，而反應器內(nèi)腔所留標本未測出豬白蛋白。尿素合成率隨時間的延長而升高，AST濃度先升后

7、降，LDH濃度則持續(xù)上升，在48～72h期間顯著增高。在整個實驗時間里，SHP的氨濃度持續(xù)降低，2h較之0h有顯著性差異，其后血氨濃度下降趨勢減緩；總膽紅素濃度持續(xù)降低，6h的總膽紅素濃度接近0h的2/3；凝血酶原時間持續(xù)降低，總降低量達5s左右；TNF-α、TGF-β1含量持續(xù)降低，0～2h內(nèi)變化最大，2h較之0h有顯著性差異，其后下降趨勢減緩。 以上結(jié)果提示：1、聚砜膜具有較好的生物相容性，乳豬肝細胞能以多細胞聚集體的形式在

8、其表面生長，同聚苯乙烯界面相比，其分泌、合成、轉(zhuǎn)化、解毒功能均顯著提高，肝細胞膜無明顯損傷。聚砜膜可以作為良好的BAL反應器膜材料。2、磁力攪動多細胞聚集體培養(yǎng)法，能在6h內(nèi)培養(yǎng)形成數(shù)量較多、形態(tài)結(jié)構(gòu)較好、大小合適的多細胞聚集體，其超微結(jié)構(gòu)基本正常，能保持較好的肝細胞功能，但仍有部分肝細胞的細胞膜受損。磁力攪動法可望成為較好的BAL細胞培養(yǎng)方式。3、聚砜膜中空纖維反應器能為肝細胞提供良好的生長代謝環(huán)境，乳豬肝細胞的多細胞聚集體在聚砜膜中