人尿源性干細(xì)胞的永生化及其誘導(dǎo)分化研究.pdf

1、目的:運用piggyBac system篩選在干細(xì)胞中能啟動基因表達的高效啟動子，選擇合適的啟動子應(yīng)用于猿腎病毒40大T抗原(SV40Tag)基因的表達，建立永生化的人尿源性干細(xì)胞(urine derived stem cell，USC)。通過對永生化尿源性干細(xì)胞的生物學(xué)鑒定，明確其干細(xì)胞分化潛能，并通過骨形成蛋白(BMP9)誘導(dǎo)分化，進一步明確永生化尿源性干細(xì)胞具有多向分化潛能，為組織工程學(xué)及再生醫(yī)學(xué)提供新型的穩(wěn)定的細(xì)胞來源。

2、　　方法:運用piggyBac轉(zhuǎn)座酶系統(tǒng)構(gòu)建并比較帶有不同啟動子的質(zhì)粒，用紅色熒光蛋白(RFP)和螢火蟲熒光素酶(firefly luciferase Fluc)作為報告基因，通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方法建立穩(wěn)定表達的細(xì)胞系。通過RFP表達強度，F(xiàn)luc定量檢測及流式細(xì)胞技術(shù)，篩選在干細(xì)胞中穩(wěn)定高效表達的啟動子。利用該啟動子構(gòu)建帶SV40Tag基因表達的質(zhì)粒，將SV40Tag基因質(zhì)粒及轉(zhuǎn)座酶質(zhì)粒(transposase)共轉(zhuǎn)染至臨床分離的人尿源

3、性干細(xì)胞中。潮霉素（Hygromycin）篩選后陽性細(xì)胞克隆并連續(xù)傳代，觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)以及增殖情況，RT-PCR，免疫熒光等檢測轉(zhuǎn)染細(xì)胞的生物學(xué)特性，細(xì)胞裸鼠皮下注射檢測其安全性。運用BMP9誘導(dǎo)成骨分化，通過體外細(xì)胞堿性磷酸酶(ALP)染色、茜素紅染色（Alizarin-S staining）、油紅O(Oil-red staining)染色、微團細(xì)胞培養(yǎng)(Micro Mass)等特異性染色檢測其成骨、成軟骨及成脂分化。體內(nèi)實驗進一步利

4、用Micro-CT，病理切片染色等檢測尿源性干細(xì)胞在BMP9誘導(dǎo)下具有多向分化功能。
　　結(jié)果:通過RFP熒光顯示，F(xiàn)luc及流式細(xì)胞定量檢測，hEFH啟動子在干細(xì)胞系中表達外源基因能力明顯強于其他啟動子，運用hEFH啟動SV40Tag基因在尿源性干細(xì)胞中表達，篩選獲得的陽性克隆擴大培養(yǎng)，即永生化尿源性干細(xì)胞(immorterlized urine derived stem cell，iUSC)，增殖能力強，能連續(xù)傳代培養(yǎng)。RT-

5、PCR證實iUSC表達SV40Tag基因，而用翻轉(zhuǎn)重組酶（Flippers recombination enzyme Flp）處理iUSC可敲除RFT-SV40Tag基因而逆轉(zhuǎn)永生化。應(yīng)用免疫熒光細(xì)胞化學(xué)技術(shù)檢測該細(xì)胞株表達干細(xì)胞表面標(biāo)志物CD73、CD44、CD90(Thy-1)、CD29(Integrin)、CD105(Endoglin)、CD166(ALCAM)、BMPRⅡ、SSEA4、CD117、CD133。應(yīng)用BMP9誘導(dǎo)iU

6、SC分化，細(xì)胞堿性磷酸酶染色、茜素紅染色、油紅O染色等顯示該細(xì)胞向成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞及脂肪細(xì)胞分化，轉(zhuǎn)染細(xì)胞裸鼠皮下及肌肉接種，4周后無腫瘤形成，通過Micro-CT及病理切片染色等顯示該細(xì)胞在BMP9誘導(dǎo)下，在體內(nèi)具有良好的成骨成軟骨及部分成脂多向分化潛能。
　　結(jié)論:運用piggyBac system成功篩選出適合于干細(xì)胞基因表達的啟動子hEFH，并用該啟動子通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)成功構(gòu)建SV40Tag永生化尿源性干細(xì)胞，生物學(xué)鑒