慢病毒載體介導的versicanRNAi對毛乳頭細胞凝集性生長影響的研究-.pdf

1、背景：
　　 毛囊是皮膚的重要附屬器，對于研究真表皮間的信號交換、傷口愈合和組織工程皮膚具有重要的生物學意義。位于毛囊基底部的毛乳頭細胞(DPCs)，作為毛囊組成的重要細胞，其凝集性生長是從胚胎毛囊發(fā)育過程中保留下來的一個重要特征，表現(xiàn)為細胞融合前呈多層聚集性生長，周圍細胞呈放射狀排列。因與誘導毛囊形成的能力密切有關，DPCs已成為研究毛囊發(fā)育、再生的重要對象。多能蛋白聚糖(versican)是一種大分子硫酸軟骨素蛋白聚糖，為D

2、PCs細胞外基質(zhì)的主要組成成份之一，其生物學功能是作為分子信號與水化分子，在細胞粘附、遷移和分化中發(fā)揮重要作用。我們在前期的實驗中發(fā)現(xiàn)，隨著培養(yǎng)代次的增加，DPCs的凝集性生長逐漸消失，versican基因及蛋白的表達也隨之降低，表明versican基因的表達與DPCs凝集性生長密切相關。因此，DPCs凝集性生長與versican基因表達之間是否存在因果關系，是我們需要進一步研究的重要內(nèi)容。這對于研究DPCs的凝集性生長和誘導毛囊形成的

3、機制，闡明毛囊形態(tài)發(fā)生和組織工程皮膚中毛囊重建等都具有十分重要的科學意義。
　　 目的：
　　 1.分離純化得到DPCs，誘導高代(第8代)DPCs重新出現(xiàn)凝集性生長。
　　 2.構建versican RNAi的慢病毒載體。
　　 3.用構建好的versican RNAi慢病毒載體感染低代(第2代)DPCs，觀察versican基因敲減后對DPCs凝集性生長的影響。
　　 方法：
　　 1

4、.采用我科建立的“二步酶消化法”分離培養(yǎng)正常人DPCs，觀察體外培養(yǎng)條件下DPCs形態(tài)和生長情況，并行α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)免疫染色鑒定。
　　 2.采用DMEM完全培養(yǎng)基加原代DPCs回收培養(yǎng)基，按1:1的比例培養(yǎng)第8代DPCs，誘導其重新出現(xiàn)凝集性生長現(xiàn)象的可行性；并行MTT、RT-PCR、western-blotting等方法檢測versican表達情況。
　　

5、 3.設計4種versican基因RNAi的靶點，經(jīng)酶切后與慢病毒載體相連，轉(zhuǎn)入293T細胞中進行小量擴增，并在靶細胞H1299中應用qPCR和western-blotting方法篩選出最佳靶點，再大量擴增，用于后續(xù)實驗。
　　 4.用篩選出的有versican基因RNAi的最佳靶點的慢病毒載體感染低代(第2代)DPCs，通過MTT、qPCR和western-blotting、鏡下觀察等方法觀察versican基因敲減對DPCs

6、凝集性生長的影響。
　　 結果：
　　 1.采用我科建立的“二步酶消化法”分離培養(yǎng)了正常人DPCs，單個細胞的形態(tài)呈梭形，形態(tài)上類似成纖維細胞，但體積較大，具有明顯的多層凝集性生長特性，體外培養(yǎng)的DPCs表達特異性標記物α-SMA。
　　 2.用DMEM完全培養(yǎng)基加原代DPCs培養(yǎng)時回收的培養(yǎng)基，按1:1的比例培養(yǎng)第8代DPCs，約3天左右，出現(xiàn)細胞的聚集性生長，約7天左右開始出現(xiàn)細胞凝集性生長的情況，細胞凝集成

7、團，呈多層放射狀生長。通過MTT檢測發(fā)現(xiàn)第2代DPCs的增殖能力較第8代DPCs和成纖維細胞強(p<0.01)，RT-PCR和western-blotting檢測發(fā)現(xiàn)第8代非凝集性生長、經(jīng)新鮮的原代培養(yǎng)基回收液誘導、重新形成了凝集性生長的DPCs與呈凝集性生長的第2代的DPCs，其mRNA和蛋白的表達明顯高于非凝集性生長的第8代DPCs和成纖維細胞(p<0.01)。
　　 3.構建四個versican RNAi靶點，在靶細胞H1

8、299中經(jīng)qPCR和western-blotting對目的基因進行篩選發(fā)現(xiàn)，4個靶點對versican基因及蛋白表達均有顯著敲減作用，效率均達到70％以上；2＃、3＃靶點敲減效率高達90％以上，其中尤以2＃靶點敲減效率最高，故將2＃確定為最佳靶點。
　　 4.用篩選出的有versican基因RNAi的最佳靶點--2＃靶點的慢病毒載體感染低代(第2代)DPCs，熒光顯微鏡下觀察GFP的表達情況，可見強綠色的熒光顆粒，轉(zhuǎn)染效率達80

9、～90％，細胞邊緣模糊，折光度明顯降低，形態(tài)略顯老化；qPCR及western-blotting檢測versican mRNA及蛋白的表達發(fā)現(xiàn)，versican mRNA及蛋白的表達均低于陰性對照組、空白對照組和成纖維細胞對照組(p<0.01)，而其余幾組比較則無顯著性差異；用MTT檢測發(fā)現(xiàn)感染病毒載體的DPCs的增殖能力明顯低于未感染病毒的DPCs，特別是在第三天以后，差異更加顯著(p<0.01)。
　　 結論：
　　

10、 1.成功誘導了高代(第8代)DPCs重新出現(xiàn)了凝集性生長，其versican基因及蛋白表達增高。這說明DPCs凝集性生長時較非凝集性生長時，versican的表達要強。
　　 2.成功構建了versican RNAi的慢病毒載體，經(jīng)qPCR及western-blotting檢測，干擾效果高達90％以上。
　　 3.低代(第2代)DPCs的versican行RNAi后，細胞的增殖能力明顯降低、細胞的形態(tài)老化，不再出現(xiàn)凝集