pEGFP-N1-H2B1質粒載體轉染對小鼠血管內皮細胞增殖和凋亡的影響.pdf

1、目的：心臟移植是臨床治療終末期心功能衰竭的唯一有效手段，但術后急、慢性排斥反應嚴重制約著該技術的廣泛推廣應用。研究誘導免疫耐受方案意義重大。母胎免疫耐受是天然的同種異體免疫耐受模型。位于母胎界面的絨毛膜組織不表達經(jīng)典的HLAI類分子而表達非經(jīng)典HLAI分子(包括HLA-G等)是母胎耐受的重要機制之一。本研究通過提取小鼠母胎界面的特異性的H281基因，構建pEGFP-N1-H281質粒載體，并轉染至小鼠血管內皮細胞，觀察pEGFP-N1-

2、H281質粒載體轉染對小鼠血管內皮細胞增殖和凋亡的影響，探討利用母胎免疫耐受介導術后移植排斥反應的機制。 方法：本研究分為兩部分： 第一部分雙酶切技術和基因測序對重組pEGFP-N1-H281質粒載體進行鑒定； 第二部分轉染pEGFP-N1-H281至小鼠血管內皮細胞，觀察pEGFP-N1-H2B1質粒載體轉染對小鼠血管內皮細胞增殖和凋亡的影響。 pEGFP-N1-H281質粒載體構建過程中，首先在小鼠胎

3、盤提取總RNA，PCR擴增H2B1基因；然后用內切酶EcoRI和BamHI雙酶切將PCR產物連接至T載體，并進行基因測序；最后利用內切酶EcoRI和BamHI對重組TS-H2B1和pEGFP-N1進行雙酶切，將H2B1亞克隆至pEGFP-N1，并利用內切酶Xhol、BamHI雙酶切法進行鑒定。轉染pEGFP-N1-H2B1質粒載體于小鼠血管內皮細胞，并對小鼠血管內皮細胞進行倒置顯微鏡下觀察、生長曲線繪制以及免疫組織化學進行鑒定。實驗分為

4、空白對照組和實驗組，分別以不同濃度的pEGFP-N1-H2B1質粒載體進行干預：細胞刺激生長實驗分別以2.5μg/mL、5μg/mL、10μg/mL，干預小鼠血管內皮細胞，細胞計數(shù)觀察1-6天小鼠血管內皮細胞的變化；MTT檢測小鼠血管內皮細胞增殖情況，分別以2.5μg/mL、5μg/mL、10μg/mL干預小鼠血管內皮細胞，以時間為橫軸，光吸收值為縱軸繪制細胞生長曲線；流式細胞儀檢測細胞調亡，分別以2.5μg/mL、5μg/mL、10μ

5、g/mL干預小鼠血管內皮細胞，轉染后24 h、48 h、72 h處理細胞，觀察隨時間變化細胞凋亡情況，并繪制曲線。 結果：pEGFP-N1-H2B1質粒載體構建過程中，1％瓊脂糖凝膠中電泳對PCR產物進行檢測，觀察到在1070 bp處有一條亮帶，于H2b1基因的分子量相對應；1％瓊脂糖凝膠中電泳對TS-H2B1載體的鑒定，觀察到三個克隆片段均在1070 bp處有一條亮帶，證明三個克隆片段均為正確克隆：基因測序顯示只有兩個堿基突變

6、；XhoI、BamHI雙酶切法對pEGFP-N1-H2B1質粒載體的鑒定，觀察到兩個克隆片段均在1070 bp處有一條亮帶，證明兩個克隆片段均為正確克隆。倒置顯微鏡觀察小鼠血管內皮細胞生長情況，培養(yǎng)48h后，可見大部分貼壁細胞連接形成網(wǎng)狀，細胞密度較低；3-5d后，內皮細胞島出現(xiàn)；約7-9d后細胞融合成片，細胞呈單層鑲嵌狀排列，呈現(xiàn)“鵝卵石樣"或“鋪路石樣”，出現(xiàn)接觸抑制現(xiàn)象。兔抗鼠抗Ⅷ抗體和熒光素標記抗體鑒定結果顯示清晰的血管內皮細胞

7、核。轉染pEGFP-N1-H2B1質粒載體于小鼠血管內皮細胞，細胞刺激生長實驗顯示隨著pEGFP-N1-H2B1質粒載體濃度的增大和時間的延長對細胞生長產生抑制作用；MTT檢測顯示空白對照組和實驗各組之間均有差異，具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；流式細胞儀檢測細胞凋亡顯示空白對照組和實驗各組之間均有差異，具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。 結論：pEGFP-N1-H2B1重組質粒載體構建成功。小鼠血管內皮細胞體外培養(yǎng)成功。pEGF