2023年全國碩士研究生考試考研英語一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁
已閱讀1頁,還剩76頁未讀 繼續(xù)免費(fèi)閱讀

下載本文檔

版權(quán)說明:本文檔由用戶提供并上傳,收益歸屬內(nèi)容提供方,若內(nèi)容存在侵權(quán),請進(jìn)行舉報(bào)或認(rèn)領(lǐng)

文檔簡介

1、目的:構(gòu)建真核表達(dá)載體pEGFP-N1/Igf1,Igf1與EGFP融合表達(dá)。通過脂質(zhì)體介導(dǎo)pEGFP-N1/Igf1轉(zhuǎn)染SD大鼠牙囊細(xì)胞,分析其對細(xì)胞增殖及分化效應(yīng)的早期影響,為Igf1基因在牙周組織工程修復(fù)與再生中的應(yīng)用提供參考。
   方法:1.根據(jù)SD大鼠Igf1基因在GeneBank中的序列設(shè)計(jì)引物。巢氏PCR擴(kuò)增出目的基因,與pMD-19T載體連接構(gòu)建pMD-19T/Igf1克隆載體。2.應(yīng)用限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ及

2、XhoⅠ對pMD-19T/Igf1與pEGFP-N1質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切。使用連接酶SolutionⅠ連接酶切后的Igf1片段及pEGFP-N1片段。轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α后進(jìn)行PCR、酶切、測序等鑒定。3.原代培養(yǎng)SD大鼠牙囊細(xì)胞,細(xì)胞傳至第四代時(shí)進(jìn)行來源鑒定。實(shí)驗(yàn)分組:①空白組、②pEGFP-N1/Igf1組、③pEGFP-N1+脂質(zhì)體組、④pEGFP-N1/Igf1+脂質(zhì)體組。4.熒光觀察:轉(zhuǎn)染后每隔24h在倒置熒光顯微鏡下觀察綠色熒光的

3、表達(dá)情況,連續(xù)觀察96 h。5.細(xì)胞活力檢測(MTT法):96孔板接種細(xì)胞,轉(zhuǎn)染后每隔24 h檢測各組細(xì)胞活力,連續(xù)檢測8d。6.ALP定量檢測(比色法):24孔板接種細(xì)胞,轉(zhuǎn)染后每隔24 h收集細(xì)胞培養(yǎng)液檢測ALP含量,連續(xù)檢測6d。7.Ⅰ型膠原Col1α1及Col1α2基因表達(dá)檢測(熒光定量PCR法):6孔板接種細(xì)胞,轉(zhuǎn)染48 h后收集細(xì)胞。以空白組為參照,計(jì)算其它處理組基因的相對表達(dá)量。
   結(jié)果:1.經(jīng)PCR、酶切、測

4、序等鑒定pEGFP-N1/Igf1質(zhì)粒構(gòu)建成功。2.綠色熒光觀察情況:轉(zhuǎn)染后48 h綠色熒光表達(dá)量最強(qiáng)。3.細(xì)胞增殖活力:轉(zhuǎn)染48 h-96 h細(xì)胞活力均為③④組<①②組(p<0.05)。轉(zhuǎn)染96 h時(shí):①組<②組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),其余時(shí)間點(diǎn)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。在轉(zhuǎn)染48 h時(shí):③組<④組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),其余時(shí)間點(diǎn)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。4.胞外ALP活性:整體趨勢:①④兩組

5、較為接近,②組ALP含量在96 h內(nèi)始終高于其它組,在72 h時(shí)達(dá)到最峰,③組ALP含量在96 h內(nèi)始終低于其它組。轉(zhuǎn)染后24 h時(shí):②組>①組>④組>③組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。轉(zhuǎn)染后48 h時(shí):②組>④組>①組>③組,除①④兩組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.7>0.5),其余均差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。轉(zhuǎn)染后72 h時(shí):②組>④組>①組>③組,除①④兩組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.908>0.5),其余均差異均有統(tǒng)

6、計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。轉(zhuǎn)染后96 h時(shí):②組>①組>④組>③組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。5.Col1α1及Col1以基因表達(dá)情況(轉(zhuǎn)染后48 h): Col1α1相對表達(dá)量:④組>②組>①組>③組;Col1α2相對表達(dá)量:④組>②組>①組>③組。
   結(jié)論:
   1.成功構(gòu)建Igf1基因C端融合EGFP的真核表達(dá)載體:pEGFP-N1/Igf1質(zhì)粒。2.脂質(zhì)體Lipofectamine2000介導(dǎo)的轉(zhuǎn)

7、染在轉(zhuǎn)染48 h時(shí)目的蛋白的表達(dá)最強(qiáng)。3.脂質(zhì)體Lipofectamine2000對SD大鼠牙囊細(xì)胞有一定的細(xì)胞毒性。pEGFP-N1/Igf1質(zhì)粒對細(xì)胞增殖有促進(jìn)作用,裸質(zhì)粒組在轉(zhuǎn)染96 h時(shí)、脂質(zhì)體組在轉(zhuǎn)染48 h時(shí)對細(xì)胞的促增殖效應(yīng)最大。4.pEGFP-N1/Igf1質(zhì)粒可增強(qiáng)胞外ALP活性,具有一定的促SD大鼠牙囊細(xì)胞成骨向分化的作用。脂質(zhì)體的細(xì)胞毒性作用降低了胞外ALP活性,脂質(zhì)體組pEGFP-N1/Igf1質(zhì)粒促進(jìn)ALP表達(dá)

溫馨提示

  • 1. 本站所有資源如無特殊說明,都需要本地電腦安裝OFFICE2007和PDF閱讀器。圖紙軟件為CAD,CAXA,PROE,UG,SolidWorks等.壓縮文件請下載最新的WinRAR軟件解壓。
  • 2. 本站的文檔不包含任何第三方提供的附件圖紙等,如果需要附件,請聯(lián)系上傳者。文件的所有權(quán)益歸上傳用戶所有。
  • 3. 本站RAR壓縮包中若帶圖紙,網(wǎng)頁內(nèi)容里面會(huì)有圖紙預(yù)覽,若沒有圖紙預(yù)覽就沒有圖紙。
  • 4. 未經(jīng)權(quán)益所有人同意不得將文件中的內(nèi)容挪作商業(yè)或盈利用途。
  • 5. 眾賞文庫僅提供信息存儲(chǔ)空間,僅對用戶上傳內(nèi)容的表現(xiàn)方式做保護(hù)處理,對用戶上傳分享的文檔內(nèi)容本身不做任何修改或編輯,并不能對任何下載內(nèi)容負(fù)責(zé)。
  • 6. 下載文件中如有侵權(quán)或不適當(dāng)內(nèi)容,請與我們聯(lián)系,我們立即糾正。
  • 7. 本站不保證下載資源的準(zhǔn)確性、安全性和完整性, 同時(shí)也不承擔(dān)用戶因使用這些下載資源對自己和他人造成任何形式的傷害或損失。

最新文檔

評論

0/150

提交評論