integrin β1對(duì)rMSCs增殖和分化影響的初步研究.pdf

1、創(chuàng)面處理是燒傷救治的重要環(huán)節(jié)之一，而創(chuàng)面的修復(fù)又是一個(gè)十分復(fù)雜的生物學(xué)過(guò)程，包含著炎癥反應(yīng)、細(xì)胞增殖等過(guò)程。目前，燒傷創(chuàng)面修復(fù)方法主要是以局部治療為主。大面積燒傷患者由于自體皮源不足，多年來(lái)運(yùn)用網(wǎng)狀皮、微粒植皮等技術(shù)來(lái)擴(kuò)大皮膚覆蓋面積，取得了一定的效果。但這些方法擴(kuò)增面積有限，難以滿足大面積皮膚缺損患者盡早封閉創(chuàng)面的需求，這些常規(guī)的方法顯然還存在著很多的不足。 組織工程學(xué)的興起和發(fā)展，為臨床解決這一難題提供了嶄新的思路和途徑。近

2、年來(lái)，由于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymalstemcells,MSCs)具有易取材、方便導(dǎo)入外源基因、自體移植不存在排斥反應(yīng)等優(yōu)點(diǎn)，在創(chuàng)傷修復(fù)方面的作用日益受到各國(guó)學(xué)者的關(guān)注。成體骨髓來(lái)源的MSCs是存在于骨髓基質(zhì)內(nèi)的非造血細(xì)胞來(lái)源的細(xì)胞亞群，它們可以在體外經(jīng)誘導(dǎo)后最終分化為成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、肌腱細(xì)胞、肌管、神經(jīng)細(xì)胞與支持造血干細(xì)胞的基質(zhì)。有學(xué)者將自體骨髓來(lái)源的細(xì)胞應(yīng)用于經(jīng)久不愈的皮膚慢性潰瘍創(chuàng)面后觀察到這些創(chuàng)面均順

3、利愈合并且能減輕瘢痕組織的產(chǎn)生，并有學(xué)者發(fā)現(xiàn)利用bFGF誘導(dǎo)MSCs向表皮細(xì)胞分化的過(guò)程中，MSCs的表面標(biāo)記物integrinβ1明顯下降并呈時(shí)間依賴(lài)性。由此可見(jiàn)MSCs有可能作為皮膚組織工程的種子細(xì)胞，參與燒傷創(chuàng)面的愈合，且integrinβ1與MSCs的分化具有一定的相關(guān)性。而本室致力于表皮干細(xì)胞的研究，先期已應(yīng)用RNA干擾的方法，發(fā)現(xiàn)下調(diào)integrinβ1的表達(dá)是表皮干細(xì)胞走向分化的重要調(diào)控因素之一。 基于以上認(rèn)識(shí)，本

4、研究擬通過(guò)體外培養(yǎng)獲得足夠數(shù)量的MSCs，利用表皮生長(zhǎng)因子(EGF)在培養(yǎng)表皮干細(xì)胞的FAD培養(yǎng)液環(huán)境下來(lái)探究誘導(dǎo)MSCs向表皮細(xì)胞分化的可能性，并探索integrinβ1的表達(dá)與rMSCs的增殖狀態(tài)的相關(guān)性。 第一部分大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離、純化及鑒定 目的：利用直接貼壁法和percoll密度梯度離心法從大鼠骨髓中分離純化MSCs。優(yōu)化MSCs的分離方法，得到高純度的MSCs，為深入研究MSCs創(chuàng)造條件。

5、方法：利用直接貼壁法和percoll密度梯度離心法從大鼠骨髓中分離純化MSCs，培養(yǎng)、傳代。同時(shí)觀察兩種方法在獲得原代細(xì)胞的不同，測(cè)第1、3、5代細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線，觀察隨傳代細(xì)胞增殖的改變。用免疫組化及免疫熒光的方法檢測(cè)第3代細(xì)胞表面標(biāo)記物。 結(jié)果：在提取的骨髓液相同的情況下，直接貼壁法富集的原代細(xì)胞量多于percoll法，且細(xì)胞形態(tài)更為單一。貼壁細(xì)胞初期呈圓形、短梭形，逐漸細(xì)胞形態(tài)趨于一致，呈長(zhǎng)梭形，胞體飽滿，10代以前，細(xì)胞生

6、長(zhǎng)活躍，增殖迅速，10代后，細(xì)胞逐漸老化，細(xì)胞碎片增多，細(xì)胞形態(tài)變?yōu)楸馄?，增殖速度明顯減緩。第1、3、5代細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線顯示，隨著細(xì)胞的傳代，細(xì)胞增殖無(wú)明顯改變。免疫組化及免疫熒光結(jié)果顯示，細(xì)胞CD44、CD106、CD29、CD90呈陰性，CD34呈陽(yáng)性。 結(jié)論：直接貼壁法是一種簡(jiǎn)便、有效分離rMSCs的方法，獲取的細(xì)胞純度較高。 第二部分integrinβ1對(duì)rMSCs增殖和分化影響的初步研究 目的：利用EG

7、F刺激rMSCs，誘導(dǎo)其向表皮細(xì)胞分化。通過(guò)轉(zhuǎn)染siIntegrinβ1，觀察integrinβ1對(duì)rMSCs增殖與分化的影響。 方法：取第三代rMSCs，隨機(jī)分5組，用含10％胎牛血清的DMEM-F12培養(yǎng)液與表皮干細(xì)胞培養(yǎng)液FAD1∶1混合培養(yǎng)，并加入濃度分別為0ng/ml、10ng/ml、20ng/ml、30ng/ml、40ng/ml的表皮生長(zhǎng)因子，每三天換液一次，找到適合濃度，分別誘導(dǎo)7d或14d后，用免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)

8、廣譜角蛋白(DAKO公司)的表達(dá)，Westernblot方法檢測(cè)誘導(dǎo)前后細(xì)胞integrinβ1的表達(dá)。并轉(zhuǎn)染siIntegrinβ1至rMSCs，潮霉素加壓篩選出穩(wěn)定表達(dá)株，測(cè)定轉(zhuǎn)染后integrinβ1含量變化及生長(zhǎng)曲線的變化。 結(jié)果：rMSCs經(jīng)誘導(dǎo)7d后，在30ng/ml及40ng/mlEGF濃度下出現(xiàn)少量細(xì)胞呈角蛋白染色抗體陽(yáng)性，提示30ng/ml濃度下即有細(xì)胞分化的可能性，在此濃度下誘導(dǎo)14d后，呈陽(yáng)性結(jié)果的細(xì)胞數(shù)量