木犀草素和橙皮素對人牙周膜細胞群增殖和分化能力影響的初步研究.pdf

1、目的：
　　本研究擬通過體外分離、培養(yǎng)人牙周膜細胞群，探索及檢測木犀草素和橙皮素對人牙周膜細胞群增殖及骨向分化能力的影響，探索此兩種中藥有效組分應(yīng)用于牙周疾病治療的可能性，為科學(xué)合理的推進中藥有效組分在牙周病的應(yīng)用，促進中藥的國際化提供理論基礎(chǔ)和實踐參考。
　　方法：
　　本研究采用蓋玻片覆蓋組織塊法對牙周膜細胞進行原代培養(yǎng)，在倒置顯微鏡下觀察牙周膜細胞的生長狀況;MTT法繪制細胞生長曲線;免疫組織化學(xué)法鑒定細胞來源;

2、并對細胞進行成骨誘導(dǎo)及茜素紅染色;采用MTT四唑鹽比色法、考馬斯亮藍染色法、ALP堿性磷酸酶檢測試劑盒、Q-PCR檢測成骨相關(guān)基因等方法觀察不同濃度木犀草素、橙皮素對牙周膜細胞群增殖、蛋白含量及骨向分化的影響。
　　結(jié)果：
　　1、鏡下觀察牙周膜細胞第3-9d從組織塊中游出，細胞排列無序，大部分呈長梭形，胞體飽滿，具有細而長的胞突，胞質(zhì)均勻，細胞核位于細胞中央、呈圓形或卵圓形。少量細胞較小且形態(tài)不規(guī)則;細胞生長曲線測定顯示第

3、3代牙周膜細胞群（periodontalligamentcellpopulation，PDLP）生長曲線呈“S”型;免疫組化結(jié)果顯示:第3代PDLP波形絲蛋白強陽性表達，角蛋白染色陰性表達;PDLP成骨誘導(dǎo):礦化誘導(dǎo)組大量礦化結(jié)節(jié)形成。
　　2、不同木犀草素和橙皮素對PDLP增殖及蛋白含量的影響
　　①MTT結(jié)果顯示:木犀草素、橙皮素作用于PDLP24、48、72h，各濃度組(100μM、10μM、1μM、0.1μM、0.0

4、1μM)均可促進牙周膜細胞的增殖(P＜0.05)。
　?、诳捡R斯亮藍染色法結(jié)果顯示:
　　1)木犀草素各實驗組細胞內(nèi)總蛋白含量均高于對照組(P＜0.05)，1μM木犀革素總蛋白含量較其他實驗組高（P＜0.05）
　　2)橙皮素各實驗組細胞內(nèi)總蛋白含量均高于對照組（P＜0.05），0.1μM木犀草素總蛋白含量較其他實驗組高（P＜0.05）。
　　3、木犀草素和橙皮素對PDLP骨向分化的影響
　?、貯LP堿性磷

5、酸酶檢測試劑盒結(jié)果顯示:
　　1)木犀草素各實驗組ALP活性均高于對照組(P＜0.05)，1μM木犀草素對應(yīng)OD值較其他各實驗組高（P＞0.05），100μM濃度木犀草素對應(yīng)OD值交其他各實驗組低(P＜0.05)
　　2)橙皮素各實驗組ALP活性均高于對照組（P＜0.05），0.1μM橙皮素ALP活性較其他各實驗組高(P＞0.05)。
　?、赒-PCR檢測結(jié)果顯示:
　　1)木犀草素作用72h，實驗組ALP表達均

6、呈上調(diào)趨勢，其中1μM組上調(diào)最為顯著，0.01μM組ALP表達上調(diào)無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05），其余實驗組ALP表達上調(diào)均有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05）。1μM和0.1μM組RUNX2表達上調(diào)，具有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05）。
　　2)橙皮素作用72h，實驗組ALP表達均呈上調(diào)趨勢，其中0.1μM組上調(diào)最為顯著，0.01μM組ALP表達上調(diào)無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05），其余實驗組ALP表達上調(diào)均有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05)。0.1μ

7、M和00.1μM組RUNX2表達上調(diào)，具有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05）。
　　結(jié)論：
　　1、蓋玻片覆蓋組織塊法可成功培養(yǎng)出牙周膜細胞群，成功率高，來源可靠，細胞生長狀態(tài)良好，且在一定條件下可以骨向分化。
　　2、一定濃度的木犀草素可以促進牙周膜細胞群的增殖和骨向分化。
　　3、一定濃度的橙皮素可以促進牙周膜細胞群的增殖和骨向分化。
　　4、本實驗為木犀草素和橙皮素進一步應(yīng)用于牙周組織再生修復(fù)提供了一定的參考