IGF1對BMSCs向成骨細(xì)胞分化的影響和機(jī)制研究.pdf

1、胰島素樣生長因子1（Insulin like growth factor1，IGF1）是一種多功能肽，可以調(diào)節(jié)細(xì)胞生長、細(xì)胞分化，以及細(xì)胞外基質(zhì)中多種蛋白表達(dá)。大量基礎(chǔ)和臨床研究證明，IGF1是骨形成和骨重建過程中的關(guān)鍵蛋白。但I(xiàn)GF1促進(jìn)或抑制骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Bone marrow mesenchymal stemcells，BMSCs)向成骨細(xì)胞分化尚未定論。此外，有關(guān)IGF1對BMSCs向成骨細(xì)胞分化影響的分子機(jī)制和信號通路尚不

2、清楚。
　　BMSCs是在骨髓中存在的一種具有多向分化潛能的干細(xì)胞，可以向脂肪細(xì)胞、成骨細(xì)胞、成軟骨細(xì)胞或肌肉細(xì)胞等進(jìn)行分化。正常情況下，BMSCs向成骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞兩者的分化處于動態(tài)平衡，其分子調(diào)控機(jī)制具有非常重要的醫(yī)學(xué)意義。具有盤狀同源區(qū)域(PDZ)結(jié)合序列的轉(zhuǎn)錄共活化因子(Transcriptional coactivator with PDZ-binding motif，TAZ)，在調(diào)節(jié)BMSCs成骨和成脂分化的平衡中發(fā)

3、揮著非常重要的作用。相關(guān)研究證明，TAZ可以促進(jìn)BMSCs向成骨細(xì)胞分化，同時阻止BMSCs向脂肪細(xì)胞分化。目前尚未清楚的是，IGF1對BMSCs向成骨細(xì)胞分化具有促進(jìn)還是抑制作用？IGF1對BMSCs中TAZ的表達(dá)有何影響？IGF1主要通過哪些通路調(diào)控TAZ的表達(dá)？
　　已有研究證明，血清IGF1濃度影響骨代謝。另外，某些藥物，如生長激素（Growth hormone，GH），可能會增加血清IGF1濃度。生長激素缺乏癥（Grow

4、th hormone deficiency，GHD）已經(jīng)被明確界定為一種綜合征，GHD病人所出現(xiàn)的一系列臨床與生化方面的異常表現(xiàn)也已知曉。與健康人群相比，成年GHD患者可以表現(xiàn)為骨密度(Bone mineral density，BMD)降低。對于接受GH治療的GHD病人，其血清IGF1濃度如何變化？GH-IGF1軸活性增加后，對GHD病人的BMD有何影響？是目前關(guān)注熱點(diǎn)之一。
　　本課題將動物細(xì)胞實(shí)驗和臨床薈萃分析相結(jié)合，從微觀和

5、宏觀兩個層面，研究IGF1對BMSCs向成骨細(xì)胞分化的影響和分子機(jī)制。研究內(nèi)容包括三個部分:第一，采用全骨髓貼壁法和密度梯度離心法分離大鼠BMSCs，并進(jìn)行原代培養(yǎng)，優(yōu)選其中一種用于后續(xù)實(shí)驗，并對BMSCs純度和向成骨細(xì)胞分化能力進(jìn)行鑒定;第二，研究IGF1對大鼠BMSCs向成骨細(xì)胞分化的影響及量效關(guān)系，確定TAZ的表達(dá)變化在其分子機(jī)制中占有的重要地位;第三，采用薈萃分析，研究GH治療對GHD患者血清IGF1的影響，以及GH-IGF1軸

6、活性增加對其BMD的影響。上述三部分研究，分別借助基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)和循證醫(yī)學(xué)兩個視角，論證了IGF1在骨代謝中的重要意義，為臨床治療骨質(zhì)疏松及其它骨礦鹽疾病提供實(shí)驗依據(jù)和理論基礎(chǔ)。
　　第一部分大鼠BMSCs的原代培養(yǎng)和鑒定
　　目的:優(yōu)選分離大鼠BMSCs的適宜方法，并對大鼠BMSCs的純度和向成骨細(xì)胞分化能力進(jìn)行鑒定。
　　方法:1采用全骨髓貼壁法和密度梯度離心法分離大鼠BMSCs，并對兩種方法獲得細(xì)胞的數(shù)量、形態(tài)、生長曲

7、線和生長周期進(jìn)行比較;2采用流式細(xì)胞術(shù)，對大鼠BMSCs表面抗原進(jìn)行檢測，以鑒定其純度;3采用成骨培養(yǎng)基對大鼠BMSCs進(jìn)行培養(yǎng)，觀察向成骨細(xì)胞誘導(dǎo)后其生長曲線的變化;4對大鼠BMSCs進(jìn)行成骨誘導(dǎo)后，檢測細(xì)胞的堿性磷酸酶(Alkaline phosphatase，ALP)活性，并對其進(jìn)行茜素紅(Alizarin red，AR)染色，鑒定其向成骨細(xì)胞分化能力，并觀察其向成骨細(xì)胞分化進(jìn)程。
　　結(jié)果:
　　1兩種分離方法獲得B

8、MSCs的比較
　　全骨髓貼壁法分離得到BMSCs的數(shù)量為密度梯度離心法的2倍以上，具有數(shù)量優(yōu)勢，兩種分離方法得到的BMSCs在形態(tài)、生長曲線和生長周期方面沒有明顯差異。因此，選擇全骨髓貼壁法用于后續(xù)實(shí)驗。
　　2大鼠BMSCs表面抗原鑒定結(jié)果
　　采用流式細(xì)胞術(shù)對全骨髓貼壁法獲得P3代細(xì)胞的表面抗原進(jìn)行鑒定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CD29/CD90共同表達(dá)的陽性率為91.41％; CD34/CD45共同表達(dá)的陽性率為1.24％。

9、
　　3大鼠BMSCs向成骨細(xì)胞分化能力鑒定結(jié)果
　　經(jīng)成骨誘導(dǎo)后，BMSCs的生長曲線出現(xiàn)明顯變化，其增殖速度明顯下降，而且對數(shù)生長期不明顯;BMSCs經(jīng)成骨誘導(dǎo)之后，ALP活性在不同時間點(diǎn)存在統(tǒng)計學(xué)差異，并存在時間遞增效應(yīng)，第3天、第7天和第14天的ALP活性高于第0天;第7天和第14天的ALP活性高于第3天;第7天和第14天的ALP活性沒有統(tǒng)計學(xué)差異;BMSCs經(jīng)成骨誘導(dǎo)之后，AR染色結(jié)果在不同時間點(diǎn)存在統(tǒng)計學(xué)差異，并

10、存在時間遞增效應(yīng)，第3天和第7天的半定量結(jié)果沒有統(tǒng)計學(xué)差異;第14天和第21天的半定量結(jié)果高于第3天和第7天;第21天的半定量結(jié)果高于第14天。
　　結(jié)論:全骨髓貼壁法分離大鼠BMSCs更適用于后續(xù)實(shí)驗;經(jīng)全骨髓貼壁法分離得到的BMSCs純度較高，符合實(shí)驗要求;經(jīng)成骨誘導(dǎo)后，細(xì)胞分化能力增強(qiáng)，增殖能力降低，并逐漸表現(xiàn)出成骨細(xì)胞特征。
　　第二部分 IGF1對大鼠BMSCs向成骨細(xì)胞分化影響的信號通路研究
　　目的:確定

11、IGF1促進(jìn)還是抑制大鼠BMSCs向成骨細(xì)胞分化及量效關(guān)系，初步探索其分子機(jī)制。
　　方法:1在成骨培養(yǎng)基中分別添加50、100和200ng/ml IGF1，觀察不同濃度IGF1對細(xì)胞ALP活性和鈣沉積量的影響，同時確定后續(xù)實(shí)驗中IGF1的適宜濃度;2采用Real-time RT PCR和Western Blot方法，檢測IGF1對TAZ，Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2(Runt-related transcription factor2

12、，RUNX2)和骨鈣素(osteocalcin，OCN)的mRNA和蛋白水平的影響;3采用小干擾RNA(Small interfering RNA，SiRNA)技術(shù)阻斷TAZ表達(dá)，觀察SiTAZ能否抑制IGF1誘導(dǎo)的BMSCs向成骨細(xì)胞分化的增加;4應(yīng)用UO126（MEK-ERK阻斷劑）和LY294002（PI3K-Akt阻斷劑），確定IGF1對TAZ表達(dá)產(chǎn)生影響的優(yōu)勢通路。
　　結(jié)果:
　　1 IGF1促進(jìn)BMSCs向成骨

13、細(xì)胞分化
　　ALP活性檢測和AR染色結(jié)果顯示，IGF1可以增加大鼠BMSCs的ALP活性和鈣沉積量，并存在劑量反應(yīng)關(guān)系，其產(chǎn)生最大效應(yīng)的濃度為100～200 ng/ml。
　　2 IGF1對TAZ，RUNX2和OCN表達(dá)的影響
　　Real-time RT-PCR和Western blot結(jié)果顯示，IGF1可以在BMSCs向成骨細(xì)胞分化早期（第3～7天）上調(diào)TAZ和RUNX2的表達(dá)，而在BMSCs向成骨細(xì)胞分化的晚期

14、（第7～14天）上調(diào)OCN的表達(dá)。
　　3 SiTAZ轉(zhuǎn)染抵消了IGF1對BMSCs向成骨細(xì)胞分化的促進(jìn)作用
　　Real-time RT-PCR和Western blot結(jié)果顯示，SiTAZ的轉(zhuǎn)染可以成功降低TAZ的mRNA水平和蛋白表達(dá)。ALP活性檢測和AR染色結(jié)果顯示，IGF1+SiTAZ組的ALP活性和AR染色半定量結(jié)果明顯低于IGF1+SiCON組;而且，ALP活性和AR染色半定量結(jié)果在SiCON組，SiTAZ組和

15、IGF1+SiTAZ三組之間沒有統(tǒng)計學(xué)差異。
　　4 IGF1主要通過MEK-ERK通路上調(diào)TAZ的表達(dá)
　　Real-time RT-PCR和Western blot結(jié)果顯示，IGF1+UO126組TAZ的mRNA和蛋白水平低于IGF1組;但是，TAZ的mRNA和蛋白水平在IGF1+LY294002組和IGF1組之間沒有統(tǒng)計學(xué)差異;此外，TAZ的mRNA和蛋白水平在對照組，UO126組，IGF1+UO126組和LY2940

16、02組之間沒有統(tǒng)計學(xué)差異。
　　結(jié)論:IGF1增加BMSCs向成骨細(xì)胞分化過程中的ALP活性和鈣沉積量，并具有劑量反應(yīng)關(guān)系;IGF1在BMSCs向成骨細(xì)胞分化早期上調(diào)TAZ和RUNX2的表達(dá)，在BMSCs向成骨細(xì)胞分化晚期上調(diào)OCN的表達(dá);通過SiRNA阻斷TAZ表達(dá)后，IGF1對BMSCs向成骨細(xì)胞分化的促進(jìn)作用被抵消;IGF對TAZ表達(dá)的影響主要是由MEK-ERK通路介導(dǎo)的。
　　第三部分 GH-IGF1軸對成年GHD患

17、者骨密度的影響:薈萃分析
　　目的:與健康人群相比，成年GHD患者往往表現(xiàn)為BMD降低，但是，對接受GH治療的GHD患者而言，GH-IGF1軸對BMD的影響尚存爭議。本研究旨在探索GH-IGF1軸活性增加對成年GHD患者的BMD是否存在積極意義。
　　方法:1對Medline，Embase和Cochrane Library數(shù)據(jù)庫進(jìn)行系統(tǒng)檢索，獲取相關(guān)文獻(xiàn);2利用標(biāo)準(zhǔn)化的電子表格對文獻(xiàn)中的研究細(xì)節(jié)和研究數(shù)據(jù)進(jìn)行提取;3建立隨機(jī)

18、效應(yīng)模型進(jìn)行薈萃分析，通過計算標(biāo)準(zhǔn)化均差(Standardized mean difference，SMD)及其95％可信區(qū)間(Confidenceinterval，CI)，以及相應(yīng)的P值來分析GH-IGF1軸對腰椎、股骨頸和全身BMD的影響;4采用Q檢驗評價納入研究的異質(zhì)性，采用Egger和Begg檢驗評價發(fā)表偏倚。
　　結(jié)果:
　　1納入薈萃分析的文獻(xiàn)
　　共有20篇文獻(xiàn)，包括936名研究對象納入本薈萃分析。

19、>　　2 GH治療對血清IGF1的影響
　　在本薈萃分析所納入的文獻(xiàn)中，幾乎所有的研究均證實(shí)，經(jīng)GH治療后的GHD患者，其血清IGF1水平顯著提高。
　　3 GH-IGF1軸對腰椎BMD的影響
　　GH-IGF1可以提高腰椎BMD(SMD=0.429，95％ CI[0.263，0.594]，P＜0.001;I2=50.0％，P=0.007 for Q test)。亞組分析結(jié)果顯示，在美洲人亞組中，GH-IGF1對腰椎B

20、MD的影響并不明顯。
　　4 GH-IGF1軸對股骨頸BMD的影響
　　GH-IGF1可以提高股骨頸BMD(SMD=0.377，95％ CI[0.158，0.595]，P=0.001;I2=67.8％，P＜0.001 for Q test)。亞組分析結(jié)果顯示，在某些亞組人群中，GH-IGF1對股骨頸BMD的影響并不明顯，包括:GH治療時間≤2年亞組和美洲人亞組。
　　5 GH-IGF1軸對全身BMD的影響
　　G

21、H-IGF1可以提高全身BMD(SMD=0.242，95％ CI[0.019，0.466]，P=0.034; I2=69.6％，P＜0.001 for Q test)。亞組分析結(jié)果顯示，在某些亞組人群中，GH-IGF1對全身BMD的影響并不明顯，包括:GH治療時間≤2年亞組;GH治療采用固定劑量亞組;采用Hologic Inc骨密度儀進(jìn)行測量的亞組;采用GE-Lunar Inc骨密度儀進(jìn)行測量的亞組;歐洲人亞組;美洲人亞組和大洋洲人亞組