重組質(zhì)粒載體pEGFP-N2-SMDF體外轉(zhuǎn)染小鼠肌源性干細(xì)胞及其鑒定.pdf

1、[研究背景]肌源性干細(xì)胞(muscle-derived stem cells，MDSCs)是一類(lèi)新近發(fā)現(xiàn)的成體干細(xì)胞，可以從動(dòng)物的骨骼肌中分離獲得，具有干細(xì)胞的自我更新和多向分化的潛能。MDSCs在體內(nèi)/外分化成肌肉細(xì)胞時(shí)不需要特定的刺激，但讓MDSCs分化成骨骼肌細(xì)胞以外的其它譜系細(xì)胞時(shí)，可能需要特殊的生長(zhǎng)因子刺激或?qū)⑵渲糜谶m宜的環(huán)境中。越來(lái)越多的研究表明，MDSCs在特定組織的發(fā)育、組織再生及修復(fù)和基因治療方面的巨大潛能。有證據(jù)顯示

2、，MDSCs能夠促進(jìn)肌纖維的再生，增強(qiáng)再生肌組織的功能，并具有分化為神經(jīng)外膜組織細(xì)胞和具有雪旺細(xì)胞(Schwann cells，SCs)表型細(xì)胞的潛能，為神經(jīng)組織工程研究中尋找雪旺細(xì)胞替代物帶來(lái)了希望。Neu基因調(diào)節(jié)素-1(neuregulin-1，NRG1)是一種由膜攜帶或分泌的多肽，屬于表皮生長(zhǎng)因子(Epidermal Growth Factor，EGF)家族，主要是由神經(jīng)元產(chǎn)生，能與ErbB酪氨酸激酶受體相結(jié)合，引起廣泛的生物學(xué)效

3、應(yīng)。根據(jù)其N(xiāo)端結(jié)構(gòu)域的不同可將其分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ3種亞型。最近的研究表明軸突中NRG1Ⅲ型(sensory and motor neuron-derived factor，SMDF)的水平是髓鞘形成的一個(gè)關(guān)鍵指標(biāo)。它不僅能促進(jìn)雪旺細(xì)胞的增殖、分化，而且還調(diào)節(jié)軸突的髓鞘化及髓鞘的厚度。SMDF的分泌在胚胎期和新生期達(dá)到高峰，而成年后的表達(dá)明顯減少。在周?chē)窠?jīng)損傷后，雪旺細(xì)胞及神經(jīng)支配的靶器官-肌組織中均可見(jiàn)其表達(dá)，然而其表達(dá)量不足以支持成年

4、軸突完成再髓鞘化過(guò)程，僅能形成包繞軸突的薄髓鞘和變短的節(jié)間長(zhǎng)度。也有研究顯示，雪旺細(xì)胞自身可以產(chǎn)生NRG1(Ⅲ型α2同源體)，以自分泌或旁分泌的形式促進(jìn)雪旺細(xì)胞增殖，并參與到清除病變軸突和髓鞘的過(guò)程中。周?chē)窠?jīng)損傷后，雪旺細(xì)胞分化和增殖是軸突再生的必備條件，而SMDF是髓鞘厚度的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。因此，提高周?chē)窠?jīng)損傷處SMDF蛋白水平為雪旺細(xì)胞的髓鞘化過(guò)程提供了一個(gè)潛在的治療策略。
　　 [研究目的](1)采用新生小鼠坐骨神經(jīng)培養(yǎng)

5、純化后的雪旺細(xì)胞條件培液，誘導(dǎo)小鼠MDSCs向雪旺細(xì)胞方向分化，為組織工程研究尋找新的雪旺細(xì)胞替代物；(2)克隆SMDF基因和構(gòu)建SMDF真核表達(dá)載體，為進(jìn)一步的功能研究提供有力的工具；(3)鑒定轉(zhuǎn)染pEGFP-N2-SMDF的MDSCs，研究SMDF基因在mRNA和蛋白水平的表達(dá)，進(jìn)一步證實(shí)構(gòu)建的載體能有效的轉(zhuǎn)導(dǎo)目的基因；(4)證實(shí)SMDF基因可促進(jìn)類(lèi)雪旺細(xì)胞的增殖、分化的，進(jìn)一步驗(yàn)證SMDF蛋白的功能，為研究周?chē)窠?jīng)損傷后SCs髓鞘

6、化過(guò)程及分子機(jī)制奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　 [研究方法](1)應(yīng)用改良的Preplate技術(shù)，從新生小鼠骨骼肌中分離MDSCs，利用抗體Desmin和Sca-1對(duì)分離得到的MDSCs進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定；(2)從新生小鼠坐骨神經(jīng)分離純化雪旺細(xì)胞，利用抗體P75NTR、S-100β進(jìn)行鑒定并收集雪旺細(xì)胞的條件培液用以誘導(dǎo)MDSCs分化為類(lèi)雪旺細(xì)胞；(3)利用WesternBlot對(duì)不同組織中SMDF蛋白的表達(dá)情況進(jìn)行分析，利用免疫組織

7、化學(xué)的方法鑒定SMDF在DRG中的表達(dá)；(4)針對(duì)小鼠SMDF基因mRNA全序列設(shè)計(jì)引物，Trizol法提取新生小鼠DRG總RNA，通過(guò)RT-PCR得到SMDF基因編碼區(qū)全序列，利用DNA重組技術(shù)將該基因片段重組到pEGFP-N2真核表達(dá)質(zhì)粒上，構(gòu)建重組真核表達(dá)載體pEGFP-N2-SMDF，并通過(guò)PCR、酶切及測(cè)序的方法進(jìn)行鑒定；(5)應(yīng)用脂質(zhì)體介導(dǎo)的方法將真核表達(dá)載體pEGFP-N2-SMDF和空質(zhì)粒pEGFP-N2轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的M

8、DSCs，通過(guò)PCR、Western-blot方法檢測(cè)轉(zhuǎn)染前后SMDF基因和蛋白的表達(dá)情況。(6)采用雪旺細(xì)胞條件培液誘導(dǎo)轉(zhuǎn)染SMDF基因的MDSCs分化為類(lèi)雪旺細(xì)胞，并采用免疫細(xì)胞化學(xué)的方法進(jìn)行鑒定。
　　 [結(jié)果](1)應(yīng)用改良的Preplate技術(shù)，從小鼠骨骼肌中分離得到MDSCs，能在體外穩(wěn)定增殖傳代，Desmin和Sca-1免疫細(xì)胞化學(xué)染色陽(yáng)性；(2)從新生小鼠坐骨神經(jīng)中分離純化得到雪旺細(xì)胞，將收集的雪旺細(xì)胞條件培液加

9、入MDSCs中，成功誘導(dǎo)出能表達(dá)雪旺細(xì)胞特異性標(biāo)記物P75NTR、S-100β的細(xì)胞；(3)將小鼠DRG中的SMDF基因克隆至真核表達(dá)載體pEGFP-N2上，雙酶切、PCR和DNA測(cè)序鑒定結(jié)果表明，插入的序列與GenBank上小鼠SMDF基因CDS序列完全符合；(4)pEGFP-N2-SMDF真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染MDSCs后，熒光顯微鏡下可見(jiàn)綠色熒光蛋白的表達(dá)；PCR和Western-blot結(jié)果顯示，重組載體pEGFP-N2-SMDF轉(zhuǎn)染

10、后的細(xì)胞中SMDFmRNA水平和蛋白水平的表達(dá)明顯高于空質(zhì)粒組及未轉(zhuǎn)染組細(xì)胞，而后兩者間比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；轉(zhuǎn)染SMDF基因的MDSCs，經(jīng)雪旺條件培液誘導(dǎo)后可分化為類(lèi)雪旺細(xì)胞，且S-100β的陽(yáng)性率明顯高于直接誘導(dǎo)的類(lèi)雪旺細(xì)胞。
　　 [結(jié)論](1)采用雪旺細(xì)胞條件培液，能夠?qū)⑿律∈蠊趋兰≈蟹蛛x得到的MDSCs誘導(dǎo)分化為類(lèi)雪旺細(xì)胞，為組織工程神經(jīng)研究找到了新的種子細(xì)胞替代物；(2)成功將重組的真核表達(dá)載體pEGFP-N2-SM