PEGFP-G1-Akt體外轉(zhuǎn)染MSCs對(duì)下肢缺血大鼠血管生成的影響.pdf

1、目的：1、克隆構(gòu)建GFP/Akt表達(dá)載體及鑒定,MSCs的分離培養(yǎng)及鑒定;2、通過(guò)脂質(zhì)體真核細(xì)胞轉(zhuǎn)染法,熒光顯微鏡下觀察GFP/Akt表達(dá)載體在鼠MSCs中的表達(dá)和定位及其對(duì)VEGFmRNA和蛋白表達(dá)的影響;3、轉(zhuǎn)染GFP/Akt的MSCs對(duì)下肢缺血大鼠血管生成的影響。
　　 方法：
　　 一、材料
　　 Wistar大鼠[SCXK(遼)2003-0009],4周～6周、體重150～200g(購(gòu)自中國(guó)醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物

2、試驗(yàn)中心)。
　　 二、方法
　　 1、克隆構(gòu)建GFP/Akt表達(dá)載體及鑒定GFP-Akt primer設(shè)計(jì)F5'-CGAGGAATTCGATGAACGACGTAGCCATTGT-3'(含EcoRI位點(diǎn))R5'-TATCAGGATCCACCTCAGGCTGTGCCACTGG-3'(含BamHI位點(diǎn))。
　　 Akt基因PCR擴(kuò)增:以pcDNA3-Akt為模板PCR擴(kuò)增此基因的開(kāi)放閱讀框架,引物上游引入EcoR I

3、酶切位點(diǎn),下游引入BamHI酶切位點(diǎn)。
　　 反應(yīng)體系如下:DW72.5μl,10×pyrobest buffer電泳液100μl。
　　 反應(yīng)條件:94℃3min,94℃50s,60℃lmin,72℃3min,72℃10min,4℃ store,30cycles。PCR產(chǎn)物用1％瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證,在約1400bp處有明顯條帶,將其回收。酶切,連接,轉(zhuǎn)化,質(zhì)粒提取,過(guò)夜培養(yǎng),次日小量提取質(zhì)粒,同時(shí)保存菌種。
　　

4、 pCDNA-Akt片斷擴(kuò)增鑒定:Rt-PCR產(chǎn)物進(jìn)行1％瓊脂糖電泳驗(yàn)證,在約1450bp處為一單一條帶,跟目的片段大小位置一致。
　　 重組質(zhì)粒酶切鑒定;取2μl質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定。經(jīng)1％瓊脂糖電泳驗(yàn)證,6個(gè)菌落經(jīng)鑒定正確,在約4700bp處有GFP載體的酶切片段,1450bp處有Akt的酶切片段。次日大量提取質(zhì)粒。
　　 濃度檢測(cè):根據(jù)OD值GFP濃度是0.85μg/μl,GFP-Akt濃度是1.874μg/μl。

5、
　　 2、MSCs分離培養(yǎng)及鑒定將Wistar大鼠(4周～6周、體重150～200g),頸椎脫臼處死,75％酒精浸泡1分鐘消毒,無(wú)菌條件下取出股骨及脛骨,剪去骨兩端,用6ml肝素化(100U/ml)PBS(PH7.40)沖洗骨髓腔,將沖洗液緩緩加于Percoll(比重1.074g/ml和1.070g/ml)分離液上梯度離心(500g,20mins)后,吸取界面層細(xì)胞,用10mlPBS將其吹打制成細(xì)胞懸液洗滌(100g,10mi

6、n)后棄上清,共兩次。用含15％FBS的L-DMEM培養(yǎng)液10ml將獲得的細(xì)胞吹打制成懸液接種于25cm2塑料培養(yǎng)瓶中,在37℃、5％CO2條件下于孵育箱中培養(yǎng),3天后半量換液以后每隔2～3d全量換液以棄除懸浮,以后培養(yǎng)和傳代按細(xì)胞培養(yǎng)常規(guī)。
　　 3、脂質(zhì)體真核細(xì)胞轉(zhuǎn)染取第二代細(xì)胞(Passage2,P2)1.0～2.0×104傳至24孔板上,待細(xì)胞長(zhǎng)至80％～90％融合,分對(duì)照組、轉(zhuǎn)染GFP組和轉(zhuǎn)染GFP-Akt組三組(每組

7、8孔),按Lipofectamine TM2000轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明方法,次日全部換液:對(duì)照組換含15％FBS的L-DMEM,轉(zhuǎn)染GFP組及轉(zhuǎn)染GFP-Akt組換含加入G418(400μg/μl)的15％FBS的L-DMEM,三天換液一次,維持篩選作用。兩周后,轉(zhuǎn)染細(xì)胞單克隆形成,其間熒光顯微鏡觀察穩(wěn)定轉(zhuǎn)染效率并照相(取同一視野倒置相差顯微鏡和熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染效率:GFP組轉(zhuǎn)染率為7.64％、GFP-Akt組轉(zhuǎn)染率為6.5％)。
　　

8、 4、實(shí)驗(yàn)大鼠分組,雙下肢缺血大鼠模型的制備及處理Wistar大鼠30只,鼠齡8～10周,體重150-250g;動(dòng)物隨機(jī)分為3組:基因治療組,非基因治療組,對(duì)照組。大鼠用1％戊巴比妥鈉(30mg/kg)腹腔注射麻醉,自其腹股溝韌帶中點(diǎn)到膝關(guān)節(jié)上做一縱型切口,分別離斷雙側(cè)的股動(dòng)脈及其分支?；蛑委熃M、非基因治療組、對(duì)照組左側(cè)內(nèi)收肌,腓腸肌取7個(gè)點(diǎn)分別共肌注1.0×107pEGFP-C1/AKT轉(zhuǎn)染的MSCs,1.0×107MSCs,PB

9、S;右側(cè)分別肌注PBS、PBS、生理鹽水做對(duì)照。
　　 5、動(dòng)脈照影
　　 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分別于術(shù)后第4周在DSA下肢動(dòng)脈造影,穿刺腹主動(dòng)脈推注70％泛影葡胺連續(xù)攝片,對(duì)照觀察雙下肢血管分布密度。
　　 6、毛細(xì)血管密度的測(cè)定處死動(dòng)物分別取其左側(cè)的內(nèi)收肌和半膜肌標(biāo)本,以10％的甲醛固定,兔抗人F-Ⅷ及CD34抗體染血管內(nèi)皮細(xì)胞,蘇木素復(fù)染,中性樹(shù)膠封片。光鏡觀察血管內(nèi)皮細(xì)胞里棕黃色。每個(gè)標(biāo)本隨機(jī)取10個(gè)視野,在高倍鏡(

10、400倍)下觀察,計(jì)算毛細(xì)血管密度(毛細(xì)血管數(shù)/高倍鏡)。
　　 7、RT-PCR檢測(cè)AKTmRNA的表達(dá)(1)分別取1.0×107細(xì)胞用RNA提取試劑Trizol提取總RNA。
　　 紫外分光光度計(jì)測(cè)樣品濃度,瓊脂糖凝膠電泳鑒定RNA完整性,用MMLV第一鏈CDNA合成試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成CDNA,按說(shuō)明書(shū)操作。
　　 取反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物4μl進(jìn)行PCR反應(yīng):
　　 95℃預(yù)變性2 min94℃變性1min55℃

11、復(fù)性1min72℃延伸1min,32個(gè)循環(huán)72℃延伸1min,32個(gè)循環(huán),72℃延伸10min內(nèi)對(duì)照:β-actin(上游5'-GCCAACCGTGAAAAGATG-3',下游5'-CCAGGAT-AGAGCCACCAAT-3')長(zhǎng)度681bp(退火溫度57℃,循環(huán)30次);VEGF(上游5'-GCCTTGCCTTGCTGCTCTA-3',下游5'-TAACTCAAGCTGCCTCGCC-3')長(zhǎng)度505bp(退火溫度55℃,循環(huán)30次

12、);Akt(上游5'-GAGGAGCGGGAAGAGTG-3',下游5'-GAGACAGGTGGAAGAAGAGC-3')長(zhǎng)度672bp(退火溫度54℃,循環(huán)30次)。
　　 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1.5％瓊脂糖凝膠電泳,溴化乙錠染色顯色,凝膠圖像分析系統(tǒng)分析,以Akt mRNA和VEGFmRNA分別與β-actin mRNA灰度比值作為Akt mRNA及VEGFmRNA半定量指標(biāo)。
　　 (2)取約100mg組織,Trizo

13、le液提取總RNA總RNA提取操作均按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。
　　 紫外分光光度計(jì)(A260/A280)檢測(cè)RNA純度。
　　 逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng):
　　 總RNA1μl,Oligo dT-Adaptor primer1μl,70℃5min,水浴2min,按順序加入10×RNAPCR緩沖液2μl、10mmol/L Dntp mixture2μl、RNA酶抑制劑20U、反轉(zhuǎn)錄酶1μl等,加去離子水至20μl。30℃10min;50℃

14、30min;99℃5min;5℃5min水浴1-2min。逆轉(zhuǎn)錄合成的cDNA在-20℃保存用于PCR,以下操作同上。
　　 8、Western blot法(1)分別取1.0×107細(xì)胞,細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞,蛋白抽提上樣,進(jìn)行10％SDS-PAGF電泳,半干法電轉(zhuǎn)移法100V恒壓電泳1.5h將蛋白轉(zhuǎn)印到PVDF膜上。室溫下用TBS阻斷1h;5％脫脂奶粉封閉1h后加一抗(工作濃度1:400),37℃,2h,洗膜;加入二抗(生物素化

15、山羊抗兔TgG抗體,工作濃度1:400),37℃,2h,洗膜;DAB顯色,照相。Western blot條帶圖像存入計(jì)算機(jī),用Quantity One圖像分析軟件包進(jìn)行光密度計(jì)算。
　　 (2)剪碎約100mg內(nèi)收肌組織,機(jī)械勻漿,離心10min。考馬斯亮藍(lán)R250染色法測(cè)總蛋白質(zhì)濃度,將各組濃度調(diào)到同一水平以下操作同上。
　　 三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS12.10統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)處理,不同組間分析采用方差分析(ANO

16、VA)檢驗(yàn),有顯著意義后用最小有意義差異t檢驗(yàn)進(jìn)行均數(shù)間的多重比較,以P＜0.05為統(tǒng)計(jì)學(xué)上有顯著差異。
　　 結(jié)果：
　　 一、MSCs的分離、培養(yǎng)及鑒定MSCs培養(yǎng)5-7 d長(zhǎng)滿瓶底,此時(shí)細(xì)胞呈平行或漩渦狀生長(zhǎng),多次傳代融合生長(zhǎng)時(shí),有更均勻有序的成纖維細(xì)胞樣分布。CD29、CD44和CD71免疫細(xì)胞化學(xué)染色均可見(jiàn)棕黃色顆粒沉積于胞膜,而CD34免疫細(xì)胞化學(xué)染色后未見(jiàn)棕黃色顆粒沉積于胞膜。
　　 二、重組質(zhì)粒的

17、鑒定和轉(zhuǎn)染pEGFP-C1/Akt重組質(zhì)粒酶切片段分別顯現(xiàn)在4700bp和1450bp處,與擴(kuò)增的pEGFP-C1和Akt目的片斷相符。
　　 三、GFP/AKT組、GFP組轉(zhuǎn)染MSCs后AKTmRNA及蛋白與VEGFmRNA及蛋白的相關(guān)性GFP/AKT組、GFP組轉(zhuǎn)染MSCs后VEGF蛋白和Akt蛋白表達(dá)顯著正相關(guān),VEGF mRNA和Akt mRNA表達(dá)亦正相關(guān)。
　　 四、轉(zhuǎn)染GFP/AKT的MSCs、MsCs對(duì)下

18、肢缺血大鼠血管生成的相關(guān)性移植后第28 d腹主動(dòng)脈造影顯示,基因治療組結(jié)扎股動(dòng)脈處的遠(yuǎn)端毛細(xì)血管生成較明顯,血管成網(wǎng)狀,優(yōu)于非基因治療組及對(duì)照組。
　　 結(jié)論：
　　 1、MSCs分離、培養(yǎng)成功。
　　 2、GFP/AKT重組質(zhì)粒的構(gòu)建、轉(zhuǎn)染成功。
　　 3、轉(zhuǎn)染GFP/AKT的MSCs組AKTmRNA及蛋白與VEGFmRNA及蛋白高于轉(zhuǎn)染GFP的MSCs組。
　　 4、轉(zhuǎn)染GFP/AKT的MSC