ECSOD基因轉(zhuǎn)染MSCs移植治療缺血性腦卒中大鼠的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、第一部分
　　ECSOD基因表達(dá)載體的構(gòu)建并轉(zhuǎn)染至骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究
　　實(shí)驗(yàn)?zāi)康?構(gòu)建胞外超氧化物歧化酶(extracellular superoxide dismutase，ECSOD)基因表達(dá)載體，經(jīng)慢病毒包裝后轉(zhuǎn)染至成年Sprague-Dawley(SD)雄性大鼠的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone mar-rowmesenchymal stem cell，MSCs)，觀察和檢測ECSOD基因的轉(zhuǎn)染效率及轉(zhuǎn)染后對(duì)細(xì)胞

2、活力的影響與ECSOD蛋白表達(dá)情況。
　　實(shí)驗(yàn)方法:利用基因工程技術(shù)從MSCs中提取總的RNA，經(jīng)PCR擴(kuò)增、載體雙酶切后，獲得ECSOD基因片段，將其基因片段連接到GV230-EGFP載體構(gòu)建GV230-EGFP-ECSOD表達(dá)載體，經(jīng)菌落PCR及測序，鑒定載體構(gòu)建是否成功，采用慢病毒包裝后將GV230-EGFP-ECSOD導(dǎo)入MSCs中，熒光顯微鏡檢測轉(zhuǎn)染效率，實(shí)時(shí)熒光定量多聚酶鏈反應(yīng)(Quantitati-ve Polyme

3、rase Chain Reaction，QPCR)對(duì)轉(zhuǎn)染后對(duì)MSCs中mRNA定量分析，MTT及EDU檢測轉(zhuǎn)染后ECSOD基因?qū)?xì)胞活力與增殖影響，Western Blot檢測ECSOD基因表達(dá)情況。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果:提取RNA產(chǎn)物經(jīng)PCR擴(kuò)增、雙酶切成功將目的基因連接至真核表達(dá)載體GV230-EGFP中，菌落PCR獲得目的基因大小和陽性對(duì)照一致，菌落PCR陽性轉(zhuǎn)化子經(jīng)測序分析與目的基因序列完全一致;慢病毒包裝的GV230-EGFP

4、-ECSOD成功轉(zhuǎn)染至MSCs，培養(yǎng)48h后在熒光顯微鏡下觀察并計(jì)算得MSCs轉(zhuǎn)染率為(75±3.6)％，進(jìn)一步采用QPCR定量測定轉(zhuǎn)染后mRNA含量明顯高于對(duì)照組。EDU與MTT檢測發(fā)現(xiàn)ECSOD基因轉(zhuǎn)染MSCs后對(duì)細(xì)胞活力無影響。Western Blot檢測證實(shí)ECSOD基因轉(zhuǎn)染MSCs后，MSCs中ECSOD蛋白呈陽性表達(dá)。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)論:成功構(gòu)建GV230-EGFP-ECSOD真核表達(dá)載體，通過慢病毒包裝轉(zhuǎn)染技術(shù)將ECSO

5、D基因轉(zhuǎn)染到MSCs中且表達(dá)ECSOD蛋白，進(jìn)而為下一步研究ECSOD基因轉(zhuǎn)染MSCs治療腦梗塞動(dòng)物模型奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　第二部分
　　ECSOD基因轉(zhuǎn)染SCs移植治療缺血性腦卒中大鼠神經(jīng)保護(hù)作用的實(shí)驗(yàn)研究
　　實(shí)驗(yàn)?zāi)康?觀察ECSOD基因轉(zhuǎn)染的MSCs移植治療缺血性腦卒中大鼠的神經(jīng)保護(hù)作用。
　　實(shí)驗(yàn)方法:將80只Sprague DaWley(SD)成年雄性大鼠，隨機(jī)分為兩組6h組(n=40)、12h組(n=

6、40)，分別將6h、12h組分為四個(gè)亞組:Model組(n=10)、PBS組(n=10)、MSCs組(n=10)、ECSOD-MSCs組(n=10);根據(jù)改良Zea Longa線栓法制作左側(cè)大腦中動(dòng)脈缺血模型，分別在造模成功后6h、12h腦缺血/再灌注，同時(shí)經(jīng)顱立體定位對(duì)后三組腦缺血大鼠分別注射10μ LPBS液、MSCs液、ECSOD-MSCs液，Model組不做處理。腦缺血/再灌注后1d、3d、7d、2w、4w進(jìn)行改良神經(jīng)功能評(píng)分(

7、Modified Neurological Severity Score，mNSS)評(píng)估預(yù)后，缺血/再灌注后1天、28天分別行MRI檢查測定大鼠腦梗塞體積變化情況。4周后取腦組織采用免疫組織化學(xué)方法測定腦組織梗塞周圍ECSOD、Bax、Bcl-2的表達(dá)情況。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果:移植后2w、4w，ECSOD-MSCs組和MSCs組的mNSS評(píng)分較PBS組、Model組低(P＜0.05)，其中ECSOD-MSCs組mNSS評(píng)分更低。移植后

8、腦梗塞體積變化的相對(duì)值比較ECSOD-MSCs組、MSCs組明顯大于PBS組、Model組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，其中ECSOD-MSCs組更大。在腦梗塞移植后28d腦梗塞及周圍ECSOD、Bax、Bcl-2的表達(dá)情況:ECSOD-MSCs組較MSCs組、PBS組、Model組ECSOD表達(dá)高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05);ECSOD-MSCs組、MSCs組較PBS組、Model組Bax陽性細(xì)胞數(shù)明顯少(P＜0.05)，